减味寿胎丸提取艺及其有效成分的药动学和血清药理学研究.pdfVIP

摘 要 lIlll i1IIIII}tilII ll Ul ilillll 目的： 以减味寿胎丸总黄酮含量为指标，通过单因素考察和正交设计，优化减味寿胎 丸总黄酮的提取工艺；利用UPLC—MS研究减味寿胎丸总黄酮中金丝桃苷和槲皮素在 大鼠体内的药代动力学参数，根据药物达峰时间，制备含药血清；原代培养人早孕 蜕膜细胞，建立米非司酮损伤人早孕蜕膜细胞模型，并以此为载体，观察含药血清 对细胞凋亡模型的影响。 方法： 1．优化减味寿胎丸总黄酮的提取工艺：以芦丁为对照品，利用比色法测定寿胎 丸提取液中的总黄酮含量，采用单因素考察及正交试验设计法优选减味寿胎丸中总 黄酮的回流提取工艺参数。 2．UPLC-MS同时测定减味寿胎丸中金丝桃苷和槲皮素：通过优化色谱条件和质 谱条件，建立UPLC-MS方法，同时检测减味寿胎丸提取液中的金丝桃苷和槲皮素。 3．大鼠血液中减昧寿胎丸的金丝桃苷和槲皮素药代动力学研究：(1)优化液质 联用条件，建立同时检测大鼠血浆中减味寿胎丸的金丝桃苷和槲皮素的UPLC-MS方 法。(2)SD雌鼠随机分为3组，每组6只，分别灌予减味寿胎丸、金丝桃苷和槲皮 法进行样品预处理，己烯雌酚作为内标。应用优化好的UPLC—MS方法测定大鼠血浆 中金丝桃苷和槲皮素的含量，获得药时曲线和药动参数。 4．人早孕蜕膜细胞凋亡模型的建立：应用复合酶消化法分离人早孕蜕膜细胞， 利用差时贴壁法纯化人早孕蜕膜细胞。施加不同浓度的米非司酮于人早孕蜕膜细胞， 通过细胞抑制率、早期凋亡率、caspase-3基因表达3个指标评价人早孕蜕膜细胞 凋亡的情况，确定适合造模的米非司酮浓度。 5．减昧寿胎丸及其有效成分含药血清对人早孕蜕膜细胞损伤模型的影响：SD 雌鼠随机分为6组，每组5只，分别予地屈孕酮、减味寿胎丸、菟丝子、金丝桃苷、 槲皮素、生理盐水灌胃，约在药物达峰时间用10％水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采 血，分离得到含药血清。选取纯度大于90％生长状态良好的人早孕蜕膜细胞，予造 模浓度的米非司酮干预后，施加制备好的含药血清干预造模细胞，通过MTT法、流 式细胞术、PCR和免疫印迹检测相关指标，以观察含药血清对细胞模型的影响。 结果： 芦丁0．112～O．56mg／mL范围内线性良好。通过单因素考察和正交试验设计得出回流 提取减味寿胎丸总黄酮的最佳条件为：乙醇浓度为60％，料液比为1：10，回流提取 2次，每次提取时间为0．5h。 2．建立了同时检测减味寿胎丸中的金丝桃苷和槲皮素的UPLC—MS方法，标准曲线 范围内，基质效应其均值处于94％一--99％范围内。大鼠口服灌胃后金丝桃苷和槲皮素 物利用度较高。 4．复合酶法分离得到人早孕蜕膜细胞，通过差时贴壁法纯化至第3代，荧光免 疫法鉴定角蛋白7为阴性，波形蛋白为阳性，泌乳素为阳性，纯度大于90％；放射 免疫法测定第卜10代细胞上清液均含有PRL，在第8代后细胞上清中PRL呈现递减 趋势。在生长旺盛期，施加5个不同浓度的米非司酮，MTT法检测生长抑制率，24h 基因表达均有增加。综合评价后，确定人早孕蜕膜细胞凋亡造模浓度为6× 10一mol／1，药物作用时间为24h。 5．各组血清药物干预人早孕蜕膜细胞凋亡模型后，与空白模型组比较，孕酮血 清组、寿胎丸血清组、菟丝子血清组、金丝桃苷血清组和槲皮素血清组的生长抑制 率、早期凋亡率、caspase一3凋亡基因表达均有所降低。 结论： 1．本研究优化确定了减味寿胎丸总黄酮回流提取工艺，具有工艺简单易行、 稳定性与重复性好、省时节能等特点。 2．建立了UPLC—MS同时测定减味寿胎丸提取液中金丝桃苷和槲皮素含量的方 法。经过验证，精密度、回收率等均符合要求，是实现质量控制的保障。 3．建立了检测大鼠血浆中金丝桃苷和槲皮素的UPLC-MS分析方法，该方法样品 前处理过程简单，分析时间短，专属性、线性关系、精密度、准确度、回收率、基 质效应等均符合要求，并成功地应用于其药代动力学研究。复方组生物利用增加， 优于单体组，说明复方中药物间有协同作用，促进了有效成分金丝桃苷和槲皮素的 吸收。 4．原代培养人早孕蜕膜细胞，建立了米非司酮诱导人早孕蜕膜细胞凋亡的模 型，以此为载体，研究了减味寿胎丸及其有效成含药血清对人早孕蜕膜细胞凋亡的