原料乳中两种病菌双重PCR检测方法的建立与应用.pdf

摘 要 近年来，随着乳制品行业规模化生产的快速发展，由乳及乳制品的安全问题所引 发的乳源性疾病，特别是细菌性食物中毒事件时有发生。因此，对乳源性病原菌的检 测研究受到了前所未有的重视。大量研究结果表明金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和致病性大肠杆菌(pathogenic Escherichia coli)是污染原料乳的两种最常见的 人畜共患病病原菌，它们通过引发乳及乳制品的腐败变质，进而导致人畜共患病和人 类食物中毒的发生。为此，加强原料乳及乳制品中金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌 的检测对预防和控制乳源性疾病的发生和流行显得至关重要。本研究在建立可同步检 测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的双重PCR方法的基础上，对合肥地区采集的新 鲜原料乳以及市售乳制品进行上述两种病原菌检测，以期探明原料乳及乳制品的污染 状况。 首先，建立了检测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的单一PCR方法。选取金黄 色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因和致病性大肠杆菌粘附素K99基因作为检测目的基因， 根据nuc基因和K99基因的保守区序列，应用Primer5.0软件设计合成2对特异性引物。 在其他因素不变的条件下，通过对引物浓度、模板浓度、退火温度和Mg2+浓度的摸索， 确定了金黄色葡萄球菌单一PCR检测方法的最佳条件是：在25μL反应体系中加入10 ×PCR Buffer 2.5μL ，dNTPs 0.5μL ，Mg2+(25mM)1.5μL ，DNA模板3.0μL ，引物(20 pmol) 各0.5μL ，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL ，双蒸水16.2μL 。各成分混合后进行95 ℃预 变性10min，94 ℃变性45s ；58 ℃退火30s ；72 ℃延伸30s，共循环30次，最后72 ℃ 后延伸5min 。致病性大肠杆菌单一PCR检测方法的最佳条件是将退火温度降至56 ℃， 其余条件同上。 其次，建立了可同时检测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的双重PCR方法。在 单一PCR检测方法的基础上，采用正交试验对引物浓度、Mg2+ 浓度、模板浓度和退火 温度在4个水平上进行L 4 16 （4 ）优化试验，确定了双重PCR方法的最佳条件为：25μL 反应体系中，10×PCR Buffer 2.5μL ，dNTPs 0.5μL ，Mg2+(25mM) 2.5μL ，DNA模板 终浓度比为1:1、引物终浓度比为1:3，Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.3μL ，双蒸水17.2μL ， 各反应物混合均匀后于95 ℃预变性10min，94 ℃变性45s ；58 ℃退火30s ；72 ℃延 伸30s，共循环30次，最后72 ℃后延伸5min 。 再次，利用建立的双重 PCR 方法检测人工模拟样品，验证其实际应用的可行性。 使用微孔滤膜过滤富集样品中的菌体后，采用改良 DNA 提取法抽提模板进行双重 PCR 检测。结果显示无需对样品进行培养，即可从富集后的样品中检测出目的基因。 从样品的富集到 PCR 产物的检测，整个过程大约需要 6h 左右，且两种病原菌的最低 I 2 检测限均达到 10 CFU/mL 。表明建立的双重PCR 方法具有较好的应用可行性。 最后，采用建立的双重PCR方法对从合肥地区采集的152份新鲜原料乳和50份市 售乳制品进行检测，同时以国标法进行对比验证。结果从50份市售乳制品中均未检测 出两种病原菌。在所检测的152份新鲜原料乳中，双重PCR方法和国标法检出金黄色 葡萄球菌的阳性率分别为75.00%和36.84%，致病性大肠杆菌的阳性率分别为47.37% 和8.55%，同时检出两种病原菌的阳性率分别为38.16%和4.61% 。两种方法检出金黄 色葡萄球菌或致病性大肠杆菌的符合率分别为61.84 %或61.18%，同时检出两种病原 菌的符合率为66.45% 。结果表明，该双重PCR方法灵敏度高、结果准确可靠、且无漏 检现象。 综上所述，本研究建立的同步检测金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌的双重PCR 方法特异性强、灵