应用免疫磁珠分及LAMP技术快速检测配方奶粉中克罗诺杆菌.pdf

ⅢII}IIⅧ洲洲㈣㈣洲I|II|』 Y2618034 应用免疫磁珠分离及LAMP技术快速检测 配方奶粉中克罗诺杆菌 博士研究生：覃昱 指导老师：罗炳德教授 摘要 一、研究背景和目的 克罗诺杆菌(cm力oIj口cr盯spp，)是一种重要的新型食源性致病菌，是囊括了 原来所有阪崎肠杆菌(E聆fe加6Ⅱc饱rs口勉确i)的新属，该属的细菌是人和动物 肠道内寄生的一种有周生鞭毛，能运动，兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。该 菌呈世界性分布，主要通过婴幼儿配方奶粉经消化道感染儿童，引起新生儿脑 膜炎、败血症和坏死性结肠炎，甚或遗留神经系统后遗症或导致死亡。 自1961年首次报道由克罗诺杆菌引起的两例脑膜炎病例，随后在全球范围 内相继出现了由该菌引起的疾病报道。2001年4月，在美国某医院新生儿重症监 护室一早产儿发烧、心动过速，脑脊液培养发现克罗诺杆菌，诊断为脑膜炎， 用抗生素治疗无效，9d后死亡。扩大检查该院49名婴儿的粪便和尿液，发现10 人为阪崎肠杆菌阳性，其原冈是使用了某批Portagen的婴儿配方奶粉。而且在该 批奶粉中也检查出了克罗诺杆菌，结果导致Ponagen婴儿配方奶粉于2002年4月 被召回。1998年，在比利时有12名婴儿因哺喂同一牌号的婴儿配方奶粉而发生 小肠结肠炎坏死。在这些婴儿的粪便和该批奶粉中同时分离出克罗诺杆菌，当 该批奶粉停用后，未有新的病例发生。2004年安徽阜阳劣质婴儿配方奶粉事件 【I 引起我国政府的高度重视，并且首次从87份婴儿配方奶粉中分离到1l株该菌，检 出率达12．16％。尽管专家目前认为是由于奶粉的营养比例问题导致小孩畸形和 死亡，但是从生病小孩的临床症状看，小孩头部肿大和反应迟钝与克罗诺杆菌 感染的症状相似，可能该菌在致病中起到重要作用。近期研究表明，克罗诺杆菌 是一种广泛存在的微生物，不仅能够存在于污染的食品和食品工厂当中，而且 在几乎所有的环境中均能够分离得到。到目前为止已从奶酪、猪肉、蔬菜、谷 类、草药、香辛料，和经过UHT灭菌的牛奶等食品中分离出克罗诺杆菌。克罗 诺杆菌致死率为10～80％，但是作为一种条件性致病菌，对新生儿具有更为严重 的危害性，其严重威胁到公共卫生安全和人类健康。 目前，针对克罗诺杆菌的检测方法主要有FDA推荐的分离培养、生化及血 清学鉴定、免疫学方法和PCR。传统的检测和定量方法主要是采用选择性培养基， 通过增菌和选择培养来实现，但其中主要存在三大问题，一是通常情况下，致 病菌在食品检测样品中的量很少，在样品处理和榆测中容易出现人为的差错； 二是非常繁琐和耗时，检测速度慢，通常需要6d以上；三是许多致病菌在常规 检测中属难培养或不可培养微生物，灵敏度较低；免疫学方法的特异性和灵敏 度均较低：PCR法敏感、准确、快速，可替代传统检测方法，但由于需要昂贵的 仪器设备、繁琐的电泳过程，以及对检测人员较高的技术要求，而使其难以在 基层单位推广和普及。因此，建立一种特异富集、快速、简便、准确的检测方 法，对克罗诺杆菌感染的流行病学调查和防治工作十分重要。 l、样品富集技术——免疫磁珠分离法(immunomagneticseparation，IMS) 生物样品往往是复杂的混合物，除少数特殊样品外，不能直接用于检测， 因此需要进行样品前处理这一重要步骤。传统的样品处理方法是从样品中分离 目的微生物，通常使用选择性培养基来获得单个纯化的目的微生物。如果对于 受到损伤的和热应激微生物还需经过增菌培养，增菌过程应包括前增菌、选择 性增菌和后增菌，因此从样品中检测病原微生物需很长的时间，而实际检测时 间主要是等待增菌的时间，这样就远远不能适应快速检测的需要。由于免疫磁 珠分离法能特异性吸附目的细菌，受到了不少学者的关注。 免疫磁珠是由直径3～5微米，有一定磁性，且分散度良好的微珠经不同单 克隆抗体包被面成的颗粒，而免疫磁珠分离方法是于70年代中期发展起来的一 项免疫学技术，其分离原理是通过磁珠表面包被的细胞特异性抗体与细胞表面 标记分子问特异结合．使抗原阳性细胞与抗原阴性细胞相分离