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微囊藻毒素LR 致大鼠卵巢颗粒细胞氧化损伤及机制探讨 中文摘要 目的： 体外培养原代大鼠卵巢颗粒细胞，观察微囊藻毒素LR 致大鼠卵巢颗粒细胞 氧化损伤对卵巢颗粒细胞增殖、激素分泌、DNA 损伤、凋亡及凋亡相关基因Bax 、 Bcl-2 的影响，并探讨微囊藻毒素LR 致大鼠卵巢颗粒细胞氧化损伤及其作用机 制。 方法： 1. 无菌条件下分离提取21-25 日龄雌性Wistar大鼠卵巢颗粒细胞，绘制细胞生长 曲线。取对数生长期细胞，以0、10、20 、30µg/mlMC-LR染毒卵巢颗粒细胞， MTT法分别检测染毒24h 、48h 、72h 的细胞增殖情况，建立大鼠原代卵巢颗 粒细胞MC-LR染毒模型。 2. 以0、10、20 、30µg/mlMC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h ，荧光法测定细胞内 活性氧（ROS ）水平、比色法测定细胞培养液中超氧化物岐化酶（T-SOD ） 活性和丙二醛（MDA ）含量。 3. 染毒条件同前，MTT法检测大鼠卵巢颗粒细胞增殖情况，电化学发光法测定 细胞培养液中雌二醇（E ）和孕酮（P ）含量。 2 4. 染毒条件同前，单细胞凝胶电泳检测大鼠卵巢颗粒细胞DNA损伤情况。 5. 染毒条件同前，TUNEL细胞凋亡检测法检测大鼠卵巢颗粒细胞凋亡情况。 6. 染毒条件同前，实时荧光定量PCR测定大鼠卵巢颗粒细胞Bax和Bcl-2基因 mRNA 的表达量变化。 结果： 1. 10、20 、30µg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h ，细胞增殖受到明显抑制 （P ﹤0.05 ），Spearman分析提示MC-LR染毒剂量与细胞增殖呈显著负相关（rs 值=-0.767 ，P=0.000 ），有明显的剂量效应关系，因此选定48h作为MC-LR染 毒大鼠卵巢颗粒细胞的最优作用时间，建立大鼠原代卵巢颗粒细胞MC-LR染 毒模型。 2. 10 、20 、30µg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h ，细胞培养液中MDA含 量随着染毒剂量增加而增高，细胞内ROS含量也随着升高，同时细胞培养液 4 中T-SOD活性随之下降；与对照组比较，20µg/ml 、30µg/ml染毒组细胞培养液 中MDA含量和细胞内ROS含量差异有统计学意义（P ﹤0.05 ）；与对照组比较， 各剂量组细胞培养液中T-SOD活性差异均有统计学意义（P ﹤0.05 ）。 3. 10、20 、30µg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h ，20µg/ml和30µg/ml剂量 组细胞培养液中雌二醇（E ）、孕酮（P ）含量显著降低，与对照组比较差异 2 有统计学意义(P ﹤0.05) 。 4. 10 、20 、30µg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h ，出现拖尾细胞数随剂量 增加而增加，提示细胞DNA损伤逐步加重。 5. 10、20 、30µg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h ，随着染毒剂量升高卵巢 颗粒细胞凋亡率升高。与对照组比较，20µg/ml和30µg/ml剂量组细胞凋亡率 差异有统计学意义。 6. 10、20 、30µg/ml MC-LR染毒大鼠卵巢颗粒细胞48h ，细胞Bax基因表达上调， Bcl-2基因表达下调，与对照组比较，20µg/ml和30µg/ml剂量组Bax 、Bcl-2基 因表达量差异有统计学意义(P ﹤0.05) 。 结论： 1. 体外实验条件下，MC-LR可引起卵巢颗粒细胞氧化应激损伤，使细胞内ROS 水平升高，细胞培养液中T-SOD活性下降，MDA含量上升，呈现明显的剂量 效应关系。 2. 体外实验条件下，MC-LR具有卵巢颗粒细胞毒性，可明显抑制大鼠卵巢颗粒 细胞的增殖，使颗粒细胞细胞凋亡率升高，DNA断裂水平增高，凋亡相关基 因Bax表达上调和Bcl-2表达下调，分泌雌二醇（E2 ）和孕酮（P ）能力降低， 并有明显的剂量-效应关系。 3. 不同剂量MC-LR 引起大鼠卵巢颗粒细胞的氧化应激与细胞损伤的改变呈现良 好的一致性，提示MC-LR通过诱导细胞内氧化应激而导致大鼠