HPLC的实际应用.ppt

周 茜 2014.10.31 高效液相色谱（HPLC）在实际样品分析中的应用 复杂基质中抗生素残留分析 环境水样中全氟羧酸类化合物分析 4 1 2 3 完整的HPLC方法建立 3 复杂基质中抗生素残留分析 研究背景 研究思路 研究结果 1 研究背景 2012年11月23日，媒体曝光了山西粟海集团养殖的肉鸡从孵出到端上餐桌，只需45天， “速成鸡”再次挑动消费者的神经。 “速成鸡”不一定真速成，抗生素滥用才是真隐忧 抗生素滥用 滥用抗生素后果 江苏省范围内145个集约化养殖场81个鸡粪样品中，金霉素检出率为42.2%，最大浓度达71.17mg kg-1；土霉素的检出率为15.6%，最大浓度为16.64 mg kg-1；强力霉素的检出率为23.4%，最大浓度为26.05mg kg-1； 上海黄浦江养猪场的养殖污水及污水贮流池连通的农田灌溉渠中均检出抗生素，2 种四环素抗生素总量为294.0~376.1μg L-1； 长期施用动物排泄物的表层土壤中，土霉素和四环素的最大残留量高达32.3和 26.4 mg/kg。 我国养殖业抗生素年排放3-4万吨，再利用后导致水体、农田、土壤和植物富集 建立高效、准确的抗生素分析方法 我国畜牧养殖业年消耗抗生素9.7万吨 四环素类66％，大环内酯类12％，青霉素类9％，其余抗生素为12％ 常用的四环素类有土霉素（OTC）、四环素（TC）、金霉素（CTC）、强力霉素（DC） R1 R2 R3 pKa1 pKa2 pKa3 OTC H OH OH 3.3 7.3 9.1 CTC Cl OH H 3.3 7.8 9.6 TC H OH H 3.3 7.6 9.3 DC H H OH 3.1 7.7 9.3 含四环素样品测定存在的两大难题 1、基体干扰严重 四环素和蛋白质键合模式 Z.X. Chi et al. / Biomacromolecules 12(2011)203–209 U. Anand et al. / J. Phys. Chem. B 115 (2011) 6312–6320 四环素对蛋白质荧光的影响 2、某些基质中四环素浓度低 MRLs：肌肉组织100 ug L-1；肝脏300 ug L-1 ；鸡蛋200 ug L-1 研究思路 1、消除样品中蛋白质干扰 2、找寻样品富集净化技术 检测痕量组分 复杂的体系 将待测组分与母体或基体分离 浓缩痕量的被测组分 样品富集及净化技术 固相萃取（SPE） SPE是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和富集的目的。 固相萃取装置图 小颗粒多孔固相吸附剂 用体积较小的溶剂洗脱或热解析 原 理= 分离+富集 一个完整的固相萃取步骤包括固相萃取柱的预处理、上样、洗去干扰物质、分析物洗脱四个步骤。 SPE柱类型 Recovery（%） OTC TC CTC DC Waters HLB（亲水亲脂柱） 100.6 101.2 98.4 97.5 Hicept MCX（混合型阳离子交换柱） 2.2 1.8 2.5 3.6 Bond Elut SAX（硅胶基强阴离子交换柱） 1.5 1.3 1.8 1.7 Bond Elut C18（反相C18柱） 74.4 73.5 87.4 92.4 30%甲醇-乙酸乙酯溶液 体积：8 mL N-乙烯基吡咯烷酮，具有极性保留能力 二乙烯基苯，具有反相吸附剂特性 超声酶解处理后，不同浓度蛋白质溶液中TCs回收率 超声酶解法能快速破坏蛋白质与四环素类抗生素的作用力，实现样品中四环素类抗生素的准确测定 酶解-固相萃取联用，LC-MS/MS分析实际样品 Method b) TCs Chicken muscle Chicken liver 100 (μg L-1) 500 (μg L-1) 100 (μg L-1) 500 (μg L-1) Mean±SD (%) Mean±SD(%) Mean±SD(%) Mean±SD(%) USEH OTC 92.80±3.83 93.05±1.45 95.65±6.43 96.35±2.53 TC 97.12±5.91 98.45±2.51 92.56±4.04 94.28±3.09 CTC 89.13±2.55 93.41±3.21 94.50±4.76 95.35±4.35 DC 96.90±1.19 102.4±2.51 97.59±4.26 99.49±2.43 b) USEH: 超声辅助酶解 两种前处理方法联用，可消除基质干扰，同时富集样品 On-line SPE：萃取和分离检测是同时进行的两个过程，人工操作减少，有机试剂消耗量少。 Off-line SPE：萃取和分离检