时间分辨荧光蛋白课件.ppt

缺乏的认识色氨酸本身的强度衰减 多个色氨酸残基存在于一个单一的蛋白质，并显示在复杂的衰变动力学当中 色氨酸本身在在中性pH溶液中显示一个多指数或者非指数衰减 1.INTENSITY DECAYS OF TRYPTOPHAN:THE ROTAMER MODEL 用时间分辨在解释蛋白质的衰变强度时的困难在于对色氨酸本身强度衰减缺乏了解 在中性水溶液中的色氨酸的强度衰减是一种已知的双指数衰减，时间近3.1和0.5 ns 色氨酸双指数衰变占主导地位是由于旋转异构体的存在 芳香族氨基酸和相关化合物在20°C，pH值7时的强度衰减 铵基淬火依赖于一定PH下色氨酸荧光量子产率 随着pH从8提高到10的氨基发生解离，量子产量和平均寿命增加约三倍 如何通过氨基淬火解释色氨酸在pH值为7的双指数衰减？ 旋转异构体在淬火过程显示了比0.5纳秒短的衰减时间 旋转异构体的存在可能是在中性pH值色氨酸的多指数衰减的主要的原因 酪氨酸和色氨酸及其中性的结构类似物 2.TIME-RESOLVED INTENSITY DECAYS OF TRYPTOPHAN AND TYROSINE色氨酸和酪氨酸的时间分辨强度衰变  过去不能够可靠地解决其衰减时间和幅度 现在已知的0.5 -和3.1-ns衰减组件显示不同的发射光谱 2.1色氨酸的衰变相关的发射光谱 假设一个样本显示多指数衰减，其衰减在不同的发射波长不同。然后描述的强度衰减 中αi（λ）是与波长相关的指数前 因素和τi的衰减时间。这个表达式假设 衰减时间与波长无关。发射 光谱由于每个组件可以计算 的短期和长期ns色氨酸的衰减成分的光谱分辨率 2.2酪氨酸及其中性衍生物的强度衰变 酪氨酸也可以显示复杂的衰变动力学，但 其性质与色氨酸是相反的。 酪氨酸及其中性类似物 N-乙酰基-L-酪氨酰胺的频域的强度衰减 酪氨酸本身显示一个单指数衰变而NATyrA显示一个双指数衰变（可能是基态旋转异构体的存在） 酪氨酸在水中的强度衰减通常是一个单一的指数 3.INTENSITY AND ANISOTROPY DECAYS OF PROTEINS蛋白的强度和各向异性衰变 由于NATA显示一个衰减时间，我们可以预期单色氨酸的蛋白质，显示单指数衰减。 但是大多数单-色氨酸的蛋白质显示双重或三重指数衰减 3.1单指数强度和核糖核酸酶T1的各向异性衰减 最单一的色氨酸蛋白显示多指数衰减。然而，有有两个已知的例外天青蛋白、核糖核酸酶T1米曲霉。大多数的核糖核酸酶不包含色氨酸。核糖核酸酶T1，它包含一个不寻常的单一的色氨酸残基，一些条件下表现一个单指数衰减 核糖核酸酶T1由104个氨基酸组成的单链多肽 核糖核酸酶T1有四个苯丙氨酸，九个酪氨酸，和一个单一的—色氨酸残基在位置59。色氨酸残基的活性位点附近。 时间分辨荧光强度和各向异性在缓冲水溶液的pH值5.5的核糖核酸酶T1衰减 3.2膜联蛋白V：钙离子敏感的单色氨酸蛋白质 对于大多数的蛋白质，甚至与单色氨酸残基，强度 和各向异性衰减更为复杂。一个例子是 膜联蛋白V，它具有一个单一的色氨酸残基 膜联蛋白是一类同源蛋白以钙依赖性方式结合到细胞膜上。 在不存在钙时膜联蛋白V呈高度非指数的强度衰减 钙会导致强度衰减变得更像一个单一的指数。表明了附近的淬灭基团在无钙的形式存在 晶体膜联蛋白Ⅴ的结构是与该现象一致，因为在钙的存在下色氨酸残基移离蛋白质 3.3有两个色氨酸蛋白质的各向异性衰减 在多色氨酸残基的蛋白中， 每个残基可以是刚性的或移动的。 在相同的蛋白质色氨酸残基在不同的位置可以有不同的运动和各向异性衰变。 时间分辨的单色氨酸的各向异性衰变的磷转运蛋白突变体。296 nm激发 4. ANISOTROPY DECAYS OF PROTEINS蛋白的各向异性衰变 前面我们看到的与蛋白质的研究基于色氨酸残基的数量有限 色氨酸残基的数目增加时，它变得不切实际 解决个别残基 在这样的情况下，必须翔实的研究野生型蛋白质的寿命分布 相移和解调的频率依赖性在学叶菌的β-葡萄糖苷酶的荧光发射因素 中性pH在5，45和85℃。 在所指示的温度S.叶菌β-色氨糖苷酶寿命分布 衰变是高度异质性，解释双峰寿命分布方面，随着温度的增加，这两个组逐步向更短的寿命迁移 5.TIME-DEPENDENT SPECTRALRELAXATION OF TRYPTOPHAN色氨酸的光谱松弛时间 在这一分析，我们假设每个色氨酸残基在所有的波长显示相同的寿命。然而，一个单一的色氨酸残基的寿命可能不是在所有的发射波长相同。 吲哚甘油20°C的强度衰减 不同的波长的发射光谱进行测量强度衰减 强度衰减在310 nm处，蓝色波长比在390 纳米衰减得更迅速 强度