Q第十章聚合酶链式反应技术.ppt

PCR反应条件 PCR反应条件优化 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量） 1、温度 变性温度：94-97 ℃ 退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右，一般55-60℃ 温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72 ℃，此时Taq酶具有较高的酶促活性 2、时间 第一次变性应给予足够时间（5-7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为 复性时间：30～60sec 延伸时间：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min 3-4Kb的DNA片段，延伸时间3-4min 10Kb的DNA片段，延伸时间15min 3、循环次数 重复次数一般设为25～35个循环 扩增反应的平台效应： 理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长 PCR 产物分析Analysis of PCR products PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)限制性 片段长度多态性 1. 分析已知突变 。 2. 突变碱基涉及酶切位点的变化。 PCR 酶