文昌鱼神经胚差减文库构建与两个胚胎发育相关基因的表达的研究.pdf

中文摘要 文昌鱼神经胚差减文库的构建和两个胚胎发育相关 基因的表达研究 摘要 文昌鱼在进化上占据重要的地位，它身体构造简单，皮肤和胚胎透明，肉眼即 可观察到内部的发育情况，而且它基本躯体构成与脊椎动物相同，因此一直以来都是 脊椎动物起源进化和发育机制研究的理想的模式动物。在文昌鱼胚胎发育的过程中， 神经胚是一个非常关键的时期，涉及到许多重要器官的形成和组织分化，尤其是神经 管的形成和体节的出现。 为了筛选在这一胚胎发育阶段中起到重要调控作用的基因，我们应用抑制性差减 杂交技术构建了白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)神经胚差减文库，测序得到的 204个EST序列去掉重复序列后进行拼接，得到了82个单独的拼接体。序列比对分析 发现82个拼接体中56％与其它物种中的已知基因同源，其余的44％与已知基因没有明 显的相似性，将其暂定为未鉴定基因。用RTqPC嘣这些基因在原肠胚和神经胚中的 差异表达进行验证，结果显示70％在神经胚阶段呈现高表达。进一步对未鉴定基因进 行详细的序列分析，发现其中3个在佛罗里达文昌鱼中存在同源基因，但在其它物种 中未发现有同源基因存在，因此认为它们是文昌鱼特有的基因。对这些特有基因进行 深入的研究将会为文昌鱼神经胚发育的研究工作提供更多有价值的资料。 在神经胚差减文库中，我们筛选到了一个脊椎动物FABP基因的同源基因 PCR扩增了该基因的cDNA全序列，并对其在不同发 -AmphiFABP，进一步应用RACE 育时期胚胎中的表达情况进行了研究，以期弄清其与脊椎动物FABP基因家族的关系。 系统进化分析表明，该基因是脊椎动物中6个FABP家族成员(月堋卯、B-FABP、 果表明，在文昌鱼神经胚早期，AmphiFABP基因的表达量远高于其它时期，其表达部 位主要集中在背部的神经外胚层和体节中，说明AmphiFABP基因与文昌鱼的神经管形 成和体节出现相关。 此外，我们还扩增了神经胚差减库中发现的文昌鱼彳删咖舾7基因的全长cDNA， 佛罗里达文昌鱼基因组的搜索结果显示，除AmphiN57夕1，文昌鱼中还有另外两个与 AmphiN57高度相似的基因ByN57L和8fN57L2，以上三种基因的蛋白都含有2个 l 文昌鱼神经胚差减文库的构建和两个胚胎发育相关基因的表达研究 统进化树的结果，推测以上三个基因由NCS家族成员倍增后特化形成，它们共同组成 异的在原肠胚和神经胚阶段表达，神经胚阶段其表达量急剧增加，且在中胚层、内胚 层和神经外胚层都有表达，由此推测该基因可能对胚胎发育过程中的神经系统形成和 胚层分化具有重要的调控作用。 鱼雌雄性腺的差减eDNA文库。正向差减杂交以卵巢为试验方、精巢为驱动方，反向 差减杂交以精巢为试验方、卵巢为驱动方，最后获得的正、反向差减文库分别含459、 隆皆能扩增出有效产物，插入片段范围为200—600bp，符合差减文库PCR产物片段的 大小。随机选取30个阳性克隆测序分析，得至1J26个有效基因片段，进一步从中选取16 个序列，用RTqPCR对文库质量进行验证，结果表明所建文库能够达到富集雌雄性腺 差异表达基因的目的。文昌鱼性腺差减文库的构建，为进一步分离、鉴定性腺分化和 发育相关基因奠定了基础。 关键词：文昌鱼；胚胎发育；差减文库；AmphiFAPB基因；AmphiN57基因 2 英文摘要 ConstructionofcDNA subtracted of neurula library amphioxus and oftwo relatedto