稳定过表达TOX3的乳腺癌MDA-MB-231细胞系的建立.pdfVIP

1l54 细胞与分子免疫学杂志 (ChinJCellMolImmuno1)2014，30(11 · 论著 · 文章编号：1007—8738(2014)11—1154—05 稳定过表达 TOX3的乳腺癌 MDA-MB-231细胞系的建立 韩翠翠 ，岳丽玲 ，杨 莹 ，简白羽 ，马立威。，刘吉成 (黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040；齐齐哈尔医学院医药科学研究中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006) [摘 要] 目的 构建人TOX高迁移率蛋白家族成员3(TOX3)基因慢病毒表达载体并建立稳定过表达TOX3的MDA-MB-231人乳腺 癌细胞系。方法 通过全基因合成法合成TOX3基因序列片段 ，并进行PCR扩增。将TOX3基因克隆到pLVEF-1a／GFP-Pure载 体中，构建pLVEF-1a／GFP—Pure-TOX3慢病毒载体。经酶切和测序鉴定后，将构建好的慢病毒载体进行病毒包装和病毒滴度检 测。用获得的慢病毒液转染MDA—MB-231人乳腺癌细胞系，通过嘌呤霉素选择性培养，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP) 的表达，采用实时定量PCR(qRT—PCR)检测MDA—MB-231细胞中TOX3mRNA的表达，Westernblot法检测 MDA-MB-231细胞中 TOX3蛋白的表达。结果 经酶切和测序鉴定，成功构建了pLVEF-1a／GFP—Pure和pLVEF一1a／GFP．Pure-TOX3慢病毒表达载体， 病毒包装后检测病毒滴度分别为2×10TU／mL和 1x10TU／mL，转染MDA—MB-231细胞后 ，GFP表达的细胞达95％以上。与 阴性对照组相比，qRT．PCR和Westernblot结果显示，MDA—MB-231-TOX3细胞中TOX3的mRNA和蛋白表达水平均明显升高。 结论 成功构建了TOX3慢病毒表达载体并建立了稳定过表达 TOX3的MDA-MB-231细胞系。 [关键词]TOX高迁移率蛋白家族成员3；慢病毒表达载体；MDA-MB-231细胞 [中图分类号]R392-33，Q786，Q813．11，Qz79 [文献标志码]A Establishment of breast cancer MDA--MB-231 cellline satbly over-e·xpressing humanTOX highmobilitygroupboxfamilymember3 HAN Cuicui，YUE Liling。 YANGYing，JIANBaiyu ，MA Liwei，LIUJicheng ， BasicMedicalCollege，HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040；MedicalScienceReserachCenter，Qiqihar MedicalUniversity，Qiqihar161006，China IAbstractl objective ToconstructtheIentiviralexpressionvectorofhumanTOXhighmobilitygroupboxfamilymember3 (T1)×3)geneandtheMDA—MB-231celllinewhichstab~over—expressesT0)Ggene．Methods T0)(3genewassynthesizedby thegenesynthesismethodandamplifiedbyPCR．andthenclonedintopLVEF·1a／GFP·PurevectortoconstructpLVEF-1a／ GFP-Pure-TO×3Ientiviralvector．Afterrestriction enzyme analysis and sequence jdentification．the IentiviraIvedorwas packagedandthetiterwasdetected．ThehumanbreastcancerMDA—MB-231cellsweretransfectedwiththe recombinant IentMraIvectorandculturedselectivelybypuromycintoacquirestablyt