扫描电子显微镜生物制样教案解析.ppt

一般从样品的外观上我们可以分为固体样品和粉末样品两种。 ①?固体样品粘样固定用的导电介质分大概按分： 高倍观察（5万倍）低倍观察（5万倍） 液体导电胶 导电胶带固定方法如图所示 ②粉末样品粘样可以直接固定在导电胶带或者液体导电胶上，注意点：如果是导电胶带，揭下来的剥离纸一定要倒着放，撒完样品后在用剥离纸干净的面压一下，固定的才会牢； ?如果是液体导电胶，最好是用水溶性的，不容易和样品发生反应，撒样品的时间点控制在导电胶快干的时候撒，才能使样品达到半浸没状态。 也可以用分散法，见图 对于坚固的样品（如骨骼、水稻成熟籽粒），可以用液氮粹断 * 第三节 扫描电镜的生物样品制备技术 一、SEM生物样品制备的基本要求 SEM生物样品制备的总要求：在不损伤样品原始结构的情况下，保证样品的体积和表面积不发生改变，充分暴露样品的微细结构。 生物样品特点：质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低以及含水量多(有的含水可达80％以上) 在对于高真空状态下的生物样品做扫描电镜观察时，必须严格地遵循一定的原则和操作程序，对样品进行必要的处理。 针对生物样品的特殊性，在进行SEM样品制备时，一般应掌握以下原则： 每一操作过程，都应注意防止对样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构。 去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防止对镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少和避免样品体积变小及收缩变形等人工损伤。 降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适当的反差和减少样品的充放电效应。 最大限度的保持样品的形貌。 二、SEM生物样品制备的基本操作程序 在SEM生物样品制备过程中，除比较坚硬的组织(如骨骼、牙齿、指甲、毛发，贝壳、昆虫及某些植物样品)和需要采用某些特殊制备技术者(如管道铸型扫描、低电压观察法等)以外，一般生物组织均需要经过处理以后，才能进行SEM观察。 生物样品制备的一般程序： 取材 固定 清洗 脱水 干燥 粘样及导电处理 上镜观察 1.取材前应作好药品及器材准备。每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。 2.取材部位要准确，取样大小要适当。以观察组织细胞表面结构为主的样品可以大一些，其直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。以观察组织细胞内部结构为主的样品，其直径应小于2mm，高度可在3mm左右。为了提高固定，脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。 3.为了使被观察的样品更近于活体状态，材料应尽量新鲜。取材用的刀片要锋利，操作要轻巧敏捷，严防对样品的挤压损伤，同时应作好对样品观察面的标记。 (一)取材 SEM样品的取材，与透射电镜的超薄切片法一样，是整个样品制备过程中的关键步骤之一。其主要要求有以下几点： 与透射电镜一样，为了把生物样品的微细结构和外部形貌真实的保留下来，对样品必须进行固定处理，对软体的组织尤为重要．另外，通过固定还可以使组织硬化，大大增强样品在下一步干燥过程中耐受表面张力变化等物理作用的能力；同时，固定作用还能提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力． (二)样品的固定 (1)戊二醛 一般配制浓度为1～4％，常用浓度为2.5％(pH7.2～7.4)。戊二醛固定剂特点是穿透力比较强，性能比较稳定，可凝固组织细胞中的蛋白成分，有利于组织坚硬，适用于较大的生物样品及器官灌流固定，应用普遍。醛类固定剂的缺点是不能增加样品的二次电子发射率，而对某些标本的穿透固定作用比较缓慢。 (2)四氧化锇 一般配制浓度为0.5～2％，常用浓度为0.5～1.0％(pH7.2～7.4)。四氧化锇对糖元以外的所有细胞成分几乎都有凝固作用，是进行超微结构研究的理想固定剂之一。四氧化锇属重金属盐类，其锇分子可以保留在固定后的细胞结构成分上，具有增加电子反差(电子染色)作用，所以可提高样品的二次电子发射率和减少样品的充放电效应。其缺点是易氧化，价格昂贵，而且其蒸气对操作者的粘膜也有一定固定损伤作用。 (3)其它固定剂 甲醛(福尔马林)、多聚甲醛、高锰酸钾(KMnO4)等亦可作为SEM样品的固定剂，但使用较少。 1.常用的固定剂 2．固定的温度及时间 固定温度：4℃为适宜 固定时间：则可因具体情况而异；戊二醛对一般软组织为1～3小时或稍长，对培养细胞和游离细胞可缩短为30分钟左右；四氧化饿的固定时间，一般在30～60分钟之间即可。 3．固定时的注意事项 (1)固定时放置样品的玻璃容器必须经过净化和干燥处理，以防止污染或产生其