生物化学核酸资料.ppt

3.7.2 核酸的紫外吸收性质 核酸含有碱基，也各有其独特的紫外线吸收光谱(磷酸和糖与核酸的吸收光谱无关)； 核酸的紫外吸收在260nm波段最强； 增色效应：将核酸水解为核苷酸，紫外吸收值通常增加30%～40% ，这种现象称～； 3.7.3 核酸结构的稳定性 P92 核酸的结构相当稳定，主要原因有3： （1）碱基对间的氢键 在DNA和RNA的双螺旋区，碱基对大小使其在螺旋内的距离适合于形成氢键； 氢键是核酸三级结构稳定的重要因素； （2 ）碱基堆积力 在DNA双螺放和RNA的螺旋区，相邻碱基平面间的距离使平面上下分布的π电子云相互作用； 环境中的水对疏水的碱基产生的作用力有助于螺旋内碱基堆积成有规律的疏水核心；等。 （3）环境中的正离子 DNA双螺旋和RNA的螺旋区外侧带负电荷的磷酸基在不与正离子结合的状念下有静电斥力； 环境中带正电荷的Na+、K 、Mg2+、Mn2+等离子，原核生物细胞内带正电荷的多胺类，真核细胞中带正电荷的组蛋白等，可与磷酸基团结合，消除静电斥力，对核酸的结构有重要的稳定作用。 3.7.4 核酸的变性 变性的概念和Tm 双链核酸的变性：DNA双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成无规则线团状态的过程； 加热、强酸或射线以及一切可以破坏核酸分子氢键的处理，都可使核酸变性； 如：DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构解体，两条链分开，形成无规则线团； 核酸变性后表现 P93 变性后：理化性质和生物功能都有显著变化： 粘性降低、沉降速率增高、紫外吸收急剧增高（增色效应）、生物功能减小或消失等； DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内，有一个相变过程； DNA的Tm 值 P92 Tm值（熔点，熔解温度：melting temperaature）：加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度； 或：紫外吸收的增加量达最大增量一半时的温度值； 影响Tm的因素 2-1 P93 （1）G-C对含量 G-C对含3个氢键， A-T对含2个氢键，故G-C对相对含量愈高， Tm愈高； （2）溶液的离子强度 离子强度较低的介质中，Tm较低。在纯水中，DNA在室温下即可变性。分子生物学研究工作中需核酸变性时，常采用较低的离子强度； 影响Tm的因素（2-2） （3）溶液的pH 高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力，pH大于11.3时，DNA完全变性。pH低于5.0时，DNA易脱嘌呤。对单链DNA进行电泳时，常在凝胶中加入NaOH以维持变性（解螺旋）状态； （4）变性剂 甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。对单链DNA进行电泳时, 常使用上述变性剂； 3.7.5 核酸的复性 P93 （1）复性的概念：当导致DNA变性的因素解除后，变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称复性； 复性的核酸原有性质可得到部分恢复； 减色效应：复性后，核酸的紫外吸收降低，这种现象称～； 复性的过程 变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称复性。 变性核酸复性时需缓慢冷却，称退火； （2）影响复性速度的因素 ① 复性的温度：因加热变性的DNA，当温度超过Tm后迅速冷却到低温时不能复性；当溶液维持在Tm以下的较高温度时，则可能复性，一般比Tm低25℃左右时最佳； ② 单链片段浓度：较高时，两条互补连彼此相碰的机会 增加，易于复性；待续； ③ 单链DNA片段长度：影响复性速度。大的线性单链 扩散速度受到妨碍，减少了互补链的碰撞机会； ④ 单链片的重杂性：复杂性越小则容易形成互补区， 因而复性较快。 ⑤ 溶液的离子强度：消除磷酸基负电荷造成的斥力， 可加快复性速度。 3.7.6 核酸的分子杂交 在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交； DNA和DNA杂交及DNA和RNA杂交在核酸技术中占重要地位； 3.8 核酸的序列测定 P95 阅读。 阅读：核酸的分离 核酸研究的首要方法是分离和测定； 核酸制备注意的问题：防止核酸降解和变性, 尽量保持其在生物体内的天然状态； 制备天然状态的核酸必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其是防止核酸酶的降解作用； 天然核酸都具有生物活性，这是检验其质量的重要指标,物理化学指标也常用来评定核酸的品质，这些指标包括：相对分子质量、紫外吸收、沉降系数、电泳迁移率、粘度等； 制备的方法因所用生物材料不同而有很大差异； 本章要点