广大-土壤中分离芽胞杆菌-副本技术报告.docVIP

综合性实验方案 土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定 一、摘要 本实验通过从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存，试验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定，根据伯杰氏细菌手册鉴定其中的种属。 实验中通过80℃水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌；再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过分区划线对初筛选菌株进一步分离纯化；然后再用选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉酶，以及产芽孢的杆菌，最后通过对产淀粉酶芽孢杆菌做相关的生理生化实验，将筛选出来的菌株进行鉴别，鉴别到了地衣芽孢杆菌和环状芽孢杆菌。 关键词：芽孢杆菌 淀粉酶 酶活测定 二、实验目的要求 了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用的方法和技术； 掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法； 掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法； 培养学生自行设计实验方案流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力； 对所学习过的微生物实验方法井陉综合技能训练； 从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各种淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况； 三、实验原理 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由有一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单的菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 芽孢杆菌是土壤细菌中最具活力的部分之一，也是土壤细菌的主要种群之一。 芽孢杆菌属实一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。多数为腐生菌，主要分布于土壤、动植物体表及水体中。由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体，因此，在工、农业生产商有较高的应用价值。 实验材料与方法 实验材料 1.1土样的采集 选取广大理南前面、广大生化楼前小河附近两处的土壤，五点法采集，边长15cm。铲去表层土，去10cm深土壤，每一个土样约200g左右（每个点40g)。将土样放入无菌的纸袋中，并记录采集的时间、地点、植被类型，4?℃?冰箱中保存备用。分别记做A土样、B土样。 1.2培养基 淀粉筛选培养基 淀粉20 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂10 g，自来水1000 ml，pH自然。 斜面种子培养基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂10~15 g，自来水1000 ml，pH 7.2~7.4。 蛋白胨液体培养基（做吲哚实验用） 蛋白胨10 g，NaCl 5g，自来水1000 ml，pH 7.2~7.4，121℃灭菌20 min。 葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验用） 蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5g，自来水1000 ml，pH 7.2~7.4，121℃灭菌20 min。 糖发酵培养基（做糖酵解试验用：葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇） 蛋白胨2 g，NaCl 5g，K2HPO4 0.2g，1%溴麝香草酚蓝水溶液3ml，待试糖10g（一般糖或醇按1%量加入，而乳糖，半乳糖按1.5%的量加入），自来水1000 ml，pH 7.2~7.4，121℃灭菌20 min。 络氨酸平板（做络氨酸水解试验用） A：L—络氨酸0.5g，悬浮于10ml蒸馏水中，110℃，20min灭菌； B：称取3.3g营养琼脂，蒸馏水100ml，121℃，20min灭菌； 然后将A液倒入融化至温热的100ml无菌的营养琼脂中，混合，即成络氨酸水解平板。 络素平板（做络素水解试验用） A：取5g脱脂奶粉加入50ml蒸馏水中，110℃，15min灭菌 B：另称1.5g琼脂溶于50ml蒸馏水中，121℃，20min灭菌。 待冷至45—50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥； 硝酸盐培养基 硝酸钾　0.2g、蛋白　5g、蒸