第三讲核酸的制备摘要.ppt

链终止法测序时可通过以下几种方法制备模板： ①插入质粒载体的双链DNA，可以采用碱变性或热变性使双链DNA变为单链，能够进行双向测序； ②用M13载体制备单链DNA——M13载体是根据复制型M13基因组改进的双链DNA，可以和质粒一样进行操作，用它感染宿主菌可产生单链模板，但只能制备小片段DNA； ③用噬菌粒（phagemid）制备单链DNA——噬菌粒含有两个复制起始位点，一个为大肠杆菌质粒起始位点，一个是来自M13、fd等单链DNA噬菌体基因组的复制起始点。当大肠杆菌中同时含有噬菌粒和辅助噬菌体时，因后者携带编码噬菌体复制酶及外壳蛋白的基因，因此可激活噬菌粒DNA复制，产生单链模板。 ④PCR产生单链模板——两个引物中一个连接有很小的磁珠，可用吸磁的办法从扩增产物中得到单链模板。不对称PCR。 DNA聚合酶在延伸多聚核苷酸时只有3′核苷酸配对正确才能进行，这可能是为何完全单链模板在无引物时不能起始复制的原因。 因为在缺少引物的情况下，聚合酶不能确定3′核苷酸配对正确与否，无法确定下一步反应。 大肠杆菌基因组复制时，每个冈崎片段长1000-2000核苷酸，约需4000个引物。 3，光点测序（pyrosequencing） 焦磷酸测序涉及四种酶： DNA聚合酶（DNA polymerase） 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 荧光素酶(luciferase) 双磷酸酶(apyrase). 反应体系: DNA单链 测序引物。 dNTP 反应底物: APS (adenosine 5′ phosphosulfate) 荧光素(luciferin) 在每一轮测序反应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一; 如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。 掺入的dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的. dATP S (deoxyadenosine alfa-thio triphosphate) 是dATP的替代物; 因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP S不是荧光素酶的底物。 硫酸化酶 催化APS和PPi形成ATP，ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。 ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin) 的转化; 氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。 光信号由CCD摄像机检测。 每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。 然后就可以加入下一种dNTP。 每次只加入一种dNTP。当反应液中发出亮点时，可知核苷酸已掺入，仪器可以记下反应。 如无亮点出现，表明该核苷酸不与模板链配对，则不会出现记录。 连续快速地依次加入，周而复始，随着链的不断延伸，相应的顺序也被阅读。 4，DNA芯片测序 将各种排列顺序的寡聚核苷酸点播在面积很小的芯片上，每个点的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置。 将待测的DNA分子与芯片温浴，凡是能杂交的寡聚核苷酸都会在确定的位置发出信号，然后根据获取的信息将寡聚核苷酸的顺序进行对比组装，拼接成完整DNA顺序。 根据统计，可测DNA片段的长度是芯片上排列的寡聚核苷酸数目的平方根。假如寡聚核苷酸的长度为8个碱基，则其可能的排列顺序为48=65536，而可读的片段长度仅为65536的平方根，等于256bp。 即使一个芯片可容纳1048576个不同的10碱基寡聚核苷酸，可读片段长也仅为1kb。 如果要完成1Mb的测序，以20个寡聚核苷酸的数目计算，芯片需携带的组合数目将达1012，只有采用极微量的电子操作才能完成。 5，自动化测序 ①荧光标记物：用不同荧光色彩的化合物标记ddNTP，ddATP标记红色荧光、ddCTP标记蓝色荧光、ddTTP标记绿色荧光、ddGTP标记黄色荧光。 这4种标记的ddNTP混合加入到一个反应中，聚合反应完成后，可以获得末端分别带有A、C、T、G标记的DNA单链。电泳分离的单链DNA条带通过监测仪时，发出不同的颜色信号，由计算机读出碱基顺序。 自动测序的原理仍然为链终止法，但将4个反应合并为一个，在一个泳道中进行电泳。 ②毛细管电泳：用毛细管电泳取代聚丙烯酰胺凝胶平板电泳，可大大提高测序的速度。 人类基因组测序中使用的电泳装置有96个泳道（一束并列的充满凝胶的毛细管），每次可同时进行96次测序，每轮实验不到2小时，一天可完成近千次反应。 序列读取采用共聚焦荧光扫描显微镜，可将核苷酸的荧光标记信号放大并由计算机读取碱基顺序。 Fluorographic detection荧光检测 蛋白质分子