酶法生产r-氨基丁酸工艺实验解析.doc

生物工程工艺大实验 ——酶法生产r-氨基丁酸工艺实验 一、实验目的与原理 1、实验目的 实验设置涉及生物产品氨基丁酸生产过程的基本单元操作和方法，强调锻炼基本操作能力，学习控制发酵培养基的配制与发酵罐的操作。掌握各种发酵实验仪器的使用方法及注意事项；掌握r-氨基丁酸酶法生产工艺，熟悉用浓缩等电法等从发酵液中提取氨基丁酸的基本流程。 实验原理 本实验利用酶法即用大肠杆菌对L-谷氨酸进行发酵，在L-谷氨酸脱羧酶作用下脱羧生成GABA和二氧化碳来制备GABA。 高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 离心原理：利用超高速的离心机将菌体与菌液分离。 活性炭脱色：利用活性碳的吸附能力将溶液中的杂质吸附除去。 抽滤：减压过滤也就是抽滤,利用抽气泵使抽滤瓶中的压强降低,达到固液分离的目的。 减压浓缩：使用抽真空的方式降低水的沸腾温度使水蒸发干燥。 乙醇沉淀：伽马-氨基丁酸易容与水而不溶于乙醇，所以利用乙醇沉淀。 实验流程 二、材料与方法 1、菌种 大肠杆菌GABA1210 2、主要仪器 HYG-Ⅱ迴转式恒温调速摇瓶柜GZX-9140?ME数显鼓风干燥箱 LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器KQ-C型全自控蒸汽发生器 BIOTECH-2002?BIOPROCESS?CONTROLLERPA98-2空气压缩机 RS-232Ⅱ精密电子天平YP1200电子天平 FORMA?700?SERIESDINGLI?LD5-10离心机 LDH系列生化培养箱SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 Heidolph?G3葡萄糖，玉米浆，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，乳糖，酵母粉，VH，青霉素，琼脂条，氢氧化钠固体，氢氧化钠溶液，活性炭，无水乙醇，L-谷氨酸℃，12h），再将二代菌种接种到种子培养基（葡萄糖0.3%，玉米浆3%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.1%， pH7.0，121℃15min）进行摇床培养，最后将种子培养基中的菌种接种到发酵罐（葡萄糖0.3%，乳糖1.6%，玉米浆3%，酵母粉0.3%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，VH 1 mg/L， pH7.0，115℃15min。）进行发酵培养，培养条件为pH7.0，温度34-36℃培养至OD600nm*20=10-15，培养时间8-10h。 4.2、谷氨酸测定 将反应结束后的发酵液放入离心管中进行离心，然后取离心管中的上清液放入仪器中用酶膜法进行谷氨酸的测定。 4.3、残糖测定 在大肠杆菌生长至对数生长末期至稳定期时，离心，过0.22 um膜。取不含菌体的滤出液用三五二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量。 4.4、pH测定 在配置培养基过程中要用pH6.4-8.0精密pH试纸测定培养基pH。发酵过程中，要用广泛pH试纸对发酵液的pH进行测定。酶促反应过程中，用pH6.4-8.0精密试纸对pH进行检测。 4.5、吸光度测定 ??1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。?　　??2.将灵敏度开关调至“1”档（若零点调节器调不到“0”时，需选用较高档。）?　　??3.根据所需波长转动波长选择钮至600nm处。?　　??4.将空白液即蒸馏水及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。?　??5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。?　　??6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。?　　??7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。 4.6、 氨基丁酸的测定 用活性炭吸附溶液中的蛋白，加入无水酒精沉淀，其后减压浓缩结晶、抽滤得晶体9.1g，理论收率为65%。 三、实验过程与结果 1、发酵培养 1.1、摇瓶种子培养记录 种子接种量：100ml×5 pH＜6.4 培养时间：21：30-8：00共10.5h、 OD600*20：0.258 转速：172r/min 测量温值PV：28.9 设定温值SV：30.0 1.2、发酵培养记录 批号30L发酵罐发酵记录 时间/h pH 溶氧/% 转速/rpm OD600 风量L/min 罐压/MPa 温度/℃ 0.14 8.52 177.7 300 0.061 5.7 0.069 33.2 1.00 6.17 139.2 300 O.059 3.8 0.032 35.8 2.00