直肠癌p53、K-ras基因突变及其临床病理意义的研究.pdfVIP

j堇望绰旦、—K-—ras薹固塞銮及其临床病理意义的研究 搏士研究生 潘志忠 专 业 肿瘤外科 导 师 万德森教授 盥 位 中山医科大学肿瘤医院腹科 摘 要 本研究探讨p53、K-ras基因突变对直肠癌的发生、发展有无 协同作用；评价直肠癌p53功能状态的检测及其堕燮；探索 用大切片免疫组化复鎏及常规H．E．染色测定直肠癌肠壁逆行扩散 ．————======：～ 一～ 堡鏖及其影响因素，以指导手术切除直肠癌的范围。 第一部分：直肠癌p53、K-ras基因突变和p53蛋白积聚与临床病 理的相关研究 f p53基因是抑癌基因。它的失活与人类多种肿瘤发生、发展有 ／L f关，故p53基因被视为“基因组卫士”，并把p53基因突变作为 预后差的…个生物学指标。 突变型p53蛋白因半衰期明显延长，而在细胞核中积聚，可 用免疫组化方法检测。但免疫组化检测结果受多种因素影响，因 ’ 而用作测定p53基因突变的意义尚有争议。 研究表明，约70％的大肠癌南腺瘤转化而成。大肠癌的发生、 发展经历正常上皮细胞一腺瘤一腺癌一癌转移的过程。此过程 ／ 、 7／j 1。变。但在肿瘤的发生、发展过程中，这些基因改变的累积作用比 ＼基因的顺序改变更为重要。而在结直肠癌中，D53、K．ras基因突 变对肿瘤的恶性转化起关键作用。研究表明，大肠癌p53基因突 变热点位于第5～8外显子，K．ras基因突变的热点位于第12～13 及第6l密码子。 本文用PCR-SSCP测定p53、K，ras基因在直肠癌的突变情况， 探讨p53、K—ras基凶共同突变对肿瘤的恶性生物学行为升级有无 协同作用；同时探讨p53免疫组化方法检测基因突变的敏感性及 其临床意义。 方法： 收集我院1996年8月至1997年10月连续入院手术治疗的直 肠癌病人97例。对所有病理玻片重新会诊，根据《中国常见恶性 肿瘤诊治规范·大肠癌分册》标准，进行组织学分类、分级和临 床病理分期。5Hm厚连续石蜡切片，分别作H．E．染色、p53蛋白免 疫组化染色、DNA提取，并用聚合酶链反应．单链构象多态性分析 用LSAB法(链酶卵白素．生物素辣根过氧化酶复合物)。每次实 验以大肠癌组织表达阳性切片作阳性对照，以正常大肠组织作阴 性对照，以PBS替代一抗作空白对照。免疫组化染色背景清晰， 肿瘤细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数达lo％～ 第5～8外显子、K．ras基因第12～13密码子突变。引物由中山医 科大学遗传学教研室合成、提供。若同时在聚丙烯酰胺凝胶上电 泳的肿瘤标本与正常组织相比出现条带的增多、减少或有迁移变＼ } 2／产＼ij 、 ， } 胞的单链，即表明基因有突变。 L。 肠壁内逆向扩散长度用大切片H．E．及LSAB免疫组化方法测 ＼量(详见第三部分)。 ＼＼结果l 1．p53蛋白积聚与临床病理指标的关系本!Jtp53免疫反应阳性61 筛选出与p53免疫反应阳性相关的临床病理因素为肿瘤的组织 分型、大体分型、大小、肠壁远端扩散4个因素(PO．05)，即 分化较差的管状腺癌、溃疡型、体积较小、发生远端肠壁扩散 的直肠癌，多伴有p53免疫反应阳性；而与患者的性别、年龄、 肿瘤的分化程度、肠壁浸润深度、区域淋巴结转移、Du