基因表达的定量检测分析.ppt

qPCR可能出现的问题及解决方法 阴性对照有信号 * * * * * * 基因表达的定量检测分析 基因表达的定量检测方法 1. 蛋白表达水平的检测： 1）定量检测分析： western blotting、ELISA、HPLC 2）蛋白质功能分析： 蛋白质亚细胞定位分析：免疫荧光技术 蛋白相互作用研究：酵母双杂交、免疫共沉淀（IP）、 荧光共振能量转移（FRET） 酶活性检测：ELISA、HPLC 2. mRNA表达水平检测： 1）半定量RT-PCR 2）Northern blot 3）实时荧光定量PCR（Realtime PCR） Northern blot 杂交 是用来检测真核生物RNA的表达量和大小，以估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。 其基本步骤包括： 1. 完整mRNA的分离 2. 根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离 3. 将RNA 转移到固相支持物（尼龙膜）上，在转移的过程中， 要保持RNA 在凝胶中的相对分布 4. 将RNA固定到支持物上（UV交联） 5. 固相RNA与探针分子（DNA或RNA）杂交 6. 除去非特异结合到固相支持物上的探针分子 7. 对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析 Realtime PCR 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量PCR原理 　　所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线或内参基因的关系对起始模板进行定量分析的方法。 与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段： 荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。 在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。 而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。 只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ） 几个常用名词概念 1. Ct 值的定义 　　 C代表Cycle，t代表threshold（阈值，临界值），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（threshold）的设定 　　PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 　　研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的 最初阶段 绝对定量分析： Log