原核基因表达及其调控技术方案.pptVIP

用氰尿酰氯活化的PEG对蛋白质的修饰作用 2、融合蛋白的纯化 将融合蛋白分割成宿主蛋白和外源蛋白的策略： （1）在融合蛋白和宿主蛋白之间加入一段可被蛋白酶识别的氨基酸序列，如Ile-Glu-Gly-Arg可被溶血因子X?识别并在C端切开，并且这一段序列在自然状态下很少出现，因此可以用于分割融合蛋白； （2）在胰岛素中没有Met，因此在基因工程胰岛素和宿主蛋白之间可以加入一个Met，而表达的融合蛋白的Met在体外可以被CNBr转移性识别和切割，从而形成2条多肽链，1条是胰岛素，另1条是宿主多肽。经过进一步的提纯，就可以得到完整的胰岛素。 3、融合蛋白的应用 （1）在大多数情况下，融合蛋白本身就是很好的终产物，无需处理，如可以用融合蛋白来制备抗体； （2）由于融合蛋白的某些功能单元，可以用于简化提纯步骤。 现已开发大量的表达融合蛋白的商业性载体： 如Invitrogen公司： 细菌表达系统：pBADHis系列、pTrcHis系列等， 酵母菌表达系统：pPIC3.5K、pPIC9K等多种。 （八）单一方向串连排列的基因 在低拷贝质粒中表达多个串连排列的基因，以增加蛋白的表达量。 限制性内切酶AvaI的应用：表达多个串连基因的表达载体的构建 AvaI 单一方向串连排列基因构建方法： （1）先把含CTCGGG序列的质粒用AvaI切开，用DNA聚合酶I补平，两端与EcoRI接头连接，外源基因的起始和终止子都可以通过EcoRI位点克隆到载体上； （2）然后把这个重组片断再用AvaI切出，切出的DNA片断两端的粘性末端不同，因此连接时只能有一个方向； （3）由于插入外源基因使用的是单一的EcoRI位点，因此基因插入的方向有2个，其中只能有一个能够表达。 （九）增强蛋白质的稳定性 构建和表达长半衰期的外源蛋白。 正常情况下蛋白质的半衰期：从几分钟到几小时不等。决定于： （1）二硫键形成情况。二硫键可以增强蛋白质的半衰期； （2）所表达的蛋白质的N端是否有特定的氨基酸。一般可以通过在N端增加1个或几个氨基酸，来使蛋白质的半衰期延长。如：在?-半乳糖苷酶的N端加上不同的氨基酸，体外存活的时间可以从2分钟到20小时不等。 （3）在可能的情况下，改变蛋白质中的“PEST”序列，但这种改变不能影响蛋白质的功能。 PEST序列：即存在于蛋白质分子内部的Pro（P）、Glu（E）、Ser（S）和Thr（T），由于在它们的两端往往存在 带正电的氨基酸残基，极易受到蛋白酶的攻击。 （十）将外源基因整合入染色体上 （1）相对稳定地存在，没有选择压力时也可长期保存； （2）外源基因的整合位点不能位于对宿主菌特别重要的基因内部； （3）一般整合到染色体上的目的基因最好也是由可调控的启动子进行调控。 外源基因的整合途径：（1）转座作用（包括插入序列）； （2）同源交换。 A、双交换的发生： 仅目的基因整合到染色体上 B、单交换： 整个质粒整合到染色体上 使用Marker可以很方便 地筛选整合重组菌株 ?-淀粉酶基因整合到染色体上的拷贝数与未发生整合但由多 拷贝质粒携带时表达活性的比较 （十一）外源蛋白的分泌 分泌途径： （1）分泌到周质区（周质空间）； （2）完全分泌到细胞外的培养基中。 大肠杆菌蛋白的途径： （1）N端有分泌信号的蛋白： 信号肽以及一组以Sec命名的蛋白：SecA、B、D、E、F和Y等， 一般仅分泌到周质空间。 （2） C端有分泌信号的蛋白： ?-溶血素（?-hemolysin）: 可完全分泌到培养基中。 （一）包含体蛋白的提取 包含体蛋白：Inclusion body 在大肠杆菌中当外源蛋白的表达量达到20％时，由于表达部位的低电势和外源蛋白分