原核生物的转录及调控技术方案.pptVIP

2、上游元件： CAP-cAMP binding site （Activator region，AR） 当：ARI + CAP-cAMP ● AR I： CAP-cAMP 的强结合位点（-70 ~ -50） ● AR II： CAP-cAMP 的弱结合位点（-50 ~ -40） cooperative effect 提高ARII 的结合效率 IR -70 ARI -40 ARII IR -50 RNA pol AR II + CAP-cAMP 复合体： 促使-35 box附近GC岛区的双螺旋结构稳定性降低，-10 box的解链温度降低，有利于转录启动 ARI ARII GC Island -35 -10 ● Null AR II → RNA pol. into -10 Box but transcription off ● ARII + CAP-cAMP promotion RNA pol. into -35 Box into -10 Box starting transcription RNA pol RNA pol α-CTD CAP-cAMP ARI ARII ARI ARII Activation transcription Up element + CAP-cAMP ＋RNA Polymerase复合体 CAP-cAMP 与RNA Polymerase的α-CTD结合，激活转录 （二）原核基因转录的起始 1、σ因子的作用： 降低全酶与一般DNA的非专一性结合力（20000倍）； 增强全酶与启动子R site、B site的专一性结合力 （100倍）； 导致RNA链的延伸缓慢 Promoter与σ factor 间的结合专效性 ●决定了 strong promoter weak promoter； ★ -35 box, -10 box的差异影响启动子与RNA pol 中σ因子的结合能力； ★不同启动子的-35，-10 box间存在较为保守的标准序列（标准启动子）； ★ σ factor is responsible for recognition of consensus sequence of promoter and only required for initiation. 2、RNA pol与启动子的结合 σ因子识别启动子上结合位点。 RNA pol全酶与-35 box结合→封闭型启动复合物； 酶向-10 box移动，并与之牢固结合，促使-10 box及起始位点处发生局部解链→开放型启动复合物； DNA解螺旋扩展到-10 box下游17bp范围。 3、转录起始位点的决定 酶与-10 box 的结合，决定了第一个起始碱基的选择。 第一个被转录的碱基离-10 box 的保守T约6~9nts。 mRNA的起始位点多为G，其次为A ，很少为U, 起始点核苷酸的两侧分别为C 和T。 4、三元复合物的形成和σ因子的解离 RNA合成一开始，就形成模板-RNA pol-RNA的三元复合物。 σ因子解离，核心酶与模板的亲和性下降到非特异性结合的水平，RNA pol在DNA链上变得容易移动，为链的延伸创造了条件； 游离的σ因子可以重新进行功能循环。 转录的起始 核心酶在σ因子帮助下特异性结合到DNA上； RNA pol与启动子-35 box 结合，形成封闭型起始复合物； 酶滑动到-10 box，转变成为开放型起始复合物，启动子活化，双链解开，模板链暴露，插入最初的2个核苷酸； 酶继续加上开头的几个NTP，形成三元起始复合物，在RNA链合成了8～9个碱基后，σ因子解离，转录开始。 Model of the interaction between E. coil RNA polymerase holoenzyme and a promoter DNA Incorporating the first few Nt 二、原核生物转录的延伸 RNA pol沿着模板链移动，RNA链不断延伸，并保持三元复合物的结构； 转录泡中的DNA螺旋前开、后合，RNA延长，不断脱离DNA； RNA链的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的区域，转录就会减慢/停顿。 17bp 螺旋解开长度 12bp DNA-RNA复合体长度 影响RNA延伸速度的因素： ① RNA pol； ② 暂停信号：导致转录速度突然出现变化的特殊序列。 GC富集区：产物RNA不易释放； IR：产物形成茎环结构，妨碍上游的模板恢复双链。 ③ 其他配基：ppNpp、