04 第四章 植物组织培养技术(二).ppt

* * * * * * * （1）真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～10天才能发现。（真菌菌落大，颜色多样，表面呈毛绒状，嗅之一般有霉味，真菌会产生菌丝） 原因：周围环境不清洁 超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大等 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。 3.污染特点 （2）细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即可发现。 （细菌菌落小，表面呈乳脂状光泽，嗅之一般有酸臭味， 细菌污染没有菌丝） 原因：材料带菌 培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。 4.预防措施 （1）防止材料带菌：避免阴雨天在室外采集外植体；材料预培养。 （2）严格外植体灭菌　　　　　　　　 （3）接种用具灭菌彻底　　　　　　　 （4）严守无菌操作规程　　　　　　　 （5）保持培养室清洁 （6）做好超净工作台检修、养护 防止材料带菌的措施 （1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。 枝条 → 水洗净→ 插入无糖的营养液或自来水抽枝，以这种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污染。 在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。 （2）多次灭菌法： 如咖啡成熟叶片的灭菌即用这种方法。首先除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在），同时去掉叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大大减少污染；其次，将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中（商品漂白粉25%的溶液），灭菌30min；第三，在无菌蒸馏水中冲洗3次；第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；第五，次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后，用蒸馏水洗3次。对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌，在层积贮藏的第一周还应增加1次灭菌处理。 （3）多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的材料： 1. 取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片； 2. 将材料放入70%—75%医用洒精中灭菌数秒钟； 3.1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min 4. 放入5%—10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐温80”数滴，灭菌5—10min； 5. 用无菌水冲洗5次。也可以在从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1mol盐酸（HCl）中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。 5.组培苗污染的处理 （1）发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 （2）对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。 （3）要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用后的处理 （二）褐变 1.褐变的概念 是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。 2.褐变原因 木质素 →→→→ 醌→ 积累造成毒害。 多酚氧化酶 [O] 4.褐变的防止措施 （1）选择适宜的外植体 （2）选择合适的培养条件 （3）外植体预处理（还原剂浸泡） （4）加快继代转接的速度　 （5）加抗氧化剂（VC、PVP、牛血清、牛蛋白） （6）0.1－0.5%活性炭　 （三）玻璃化 1.概念 玻璃化是试管苗的一种生理失调症，在植物材料进行离体培养时，有些培养物的嫩茎或叶片呈现半透明或水渍状的现象。　 形态：植株矮小，节间短，叶水渍状、半透明、脆易碎。 2.原因：　　 （1）激素浓度（尤其CTK）增加或CTK╱IAA高　　　　　　　　　　　 （2）琼脂浓度低 　　　　　　　　 （3）光照时间大于15h　　　　　　　 （4）温度低，湿度大　　　　　　　　　　　 （5）通风条件不好　　　　　　　　 （6）培养基离子种类及比例不适宜 3.预防措施：　　　　　　　　 （1）适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基的水势。　　 （2）适当降低CTK和GA的浓度。考虑加入适当的脱落酸。 （3）增加自然光照，控制光照时间；增加容器通气，控制温度。 （4）加入其他物质（如活性炭、多效唑、