原核表达之引物设计预案.ppt

原核表达 之 引物设计 引物设计原则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计 2.引物长度一般在15~30碱基之间 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃ Tm= 4（G+C）+2（A+T） 4.引物3′端要避开密码子的第3位 5.引物3′端不能选择A，最好选择T 6. 碱基要随机分布 引物设计原则 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列 8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构 11. 引物应具有特异性 常用引物设计软件 Premier Primer 5.0 Oligo 6.0 Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Premier Primer 5.0 主要功能: 1.自动搜索 2.引物设计 3.限制性内切酶位点分析 4.DNA 基元(motif)查找 5.同源性分析 Oligo 6.0 1.功能较Premier Primer 5.0更为单一，主要是引物设计及引物评价 2.常与Premier Primer 5.0联合使用进行原核表达所用引物的设计 原核表达引物设计实例分析 鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer） ompA 鸭疫里氏杆菌 ompA序列 ATGGACAAGGAGTTTATGTTGATGACTGGTCTTGGTCTTCAGCTTAAATTTGCTGGTCTTCTTTTTGGAA ACGAAGATGCGTGGTTTGACCCTTATGTAAGAGTTGGAGCCAACTATTTGAGACACGACTATACAGGTCT TACGTTCCCTGTGACTGATAGCTACAATGATGTAACTTACGCGGGGTATAGCGAAAATAAACCATACACT CAAGGAAGAGCGGATCATTTTGCTTTATCAACAGGTTTAGGTACAAACATTTGGTTAACTAAGAACTTTG GTCTTGGTATCCAAGGGGATTATGTTTCTACTCCAGTAGATAAGTCTGGATTGGCTAACTTTTGGCAAGC GTCAGCTTCATTGAACTTTAGATTTGGTAACAGAGATAAGGATAAGGATGGAGTGTTAGATAAAGACGAT TTATGTCCAGAAATACCAGGTTTACCTGAATTCCAAGGTTGTCCAGATACAGATGGCGATGGAGTTCCAG ATAAAGATGATAACTGTCCAGAAGTTGCAGGACCAGTTGAAAACAACGGTTGTCCTTGGCCAGATACAGA CAAAGATGGTGTATTGGATAAAGACGATGCTTGTGTTGATGTAGCTGGACCTGCTGAAAACAATGGTTGT CCTTGGCCAGATACAGATAATGATGGAGTATTAGATAAAGATGATAAGTGTCCTAATGTTCCAGGTCTTC CAGAATACAAAGGTTGTCCTAAGCCTCAGGAAGCGTATGCAGTTGAAGCAACAGGAGCATTAAAGGGTAT ATTCTTCAACTTTAATAAAGCATCTATCAGACCTGAATCTAATACTAAGTTAGATCAAGCTGCTGAAGTG ATTAAGTCTTCTAACGGAGGTACTTTCTTAGTGGTAGGTCATACGGATGTTAAGGGTAATGCTAACTACA ACTTGAAACTTTCTAGAGAAAGAGCTGCATCTGTAGTAGCTGCTTTAGAAGCTAGAGGAGTTAATCCATC TCAGTTAAAATCTAAAGGGGTTGGTTCTGCTGAAGCTACAGTACCAGCGTCTGCTTCTAACGAAGAGAGA ATGAAAGACAGAAAAGTGGTTGTAGAAGCAATCAGCGGATCTGCTTGGGAAGCTCTTCAAAAGTCTGATC TTCCAGTAGTGAAGAAAAAAGTAGTAAAAAAGAAAAGAAAATAA 查看有无信号肽（Signal Peptide） 打开Oligo 6.0 点击 “ｃｈａｎｇｅ”　＞＞＞＞　“Current oligo length　Ｆ９” 　 点击“Ａｎａｌｙｚｅ”＞＞＞＞“Ｆａｌｓｅ　Ｐｒｉｍｉｎｇ　ｓｉｔｅｓ”＞“Ｕｐｐｅｒ　ｐｒｉｍｅｒ” 引物信息保存方式 查找酶切位点 打开Primer Premier “File” “New” “New DNA Squence” * 自从1985年