原核蛋白表达与纯化.预案.pptVIP

The key of Prokaryotic protein expression and purification 无β-ME 有β-ME N端融合 C端融合 蛋白提前洗脱 洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值 改变洗脱条件 蛋白结合能力弱 下调初始咪唑浓度 蛋白洗脱无检出 洗脱条件不合适——咪唑浓度、pH值 增加洗脱强度 蛋白结合能力强 上调初始咪唑浓度 蛋白浓度低 Western Blot 优化表达 蛋白未结合或被提前洗涤 电泳检查全部样品：上样前、流出、洗涤、洗脱 S FT Wash Elute1 Elute2 Elute3 Elute4 Elute5 咪唑浓度： Lane S： 10 mMLane Wash ： 20 mM Lane Elute1~5： 40 mM, 80 mM, 120 mM, 160 mM, 200 mM GST标签基本原理与特点 GST： Glutathione S-transferase，谷胱甘肽S-转移酶 填料： 固定于基质的谷胱甘肽 原理： GST与谷胱甘肽的特异性结合（酶与底物） 洗脱： 还原型谷胱甘肽 特点（以pGEX系统为例） N端融合 有助正确折叠，多为可溶表达 不适用于变性条件的纯化 标签可以切除 填料没有理想的再生方法 GST GST 融合蛋白 10 mM Glutathione 离子交换层析 离子交换层析原理 离子交换层析分类 离子交换层析特点 离子交换层析原理 无表达或表达量低 载体-菌株搭配不当 摸索最佳的组合 T7lac T7/T7lac tac tac 启动子 同上 BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS Rosetta(DE3) OrigamiB(DE3) BL21 BL21 菌株 pEASY pET pMal pGEX 载体 无表达或表达量低 稀有密码子 影响： 翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低或无表达 应对： 在宿主中补充稀有密码子的tRNA Rosetta系列菌株（Novagen公司） 1：BL21(DE3)； 2：Rosetta(DE3) ； 3：BL21(DE3)pLysS 目的蛋白 M 1 2 3 无表达或表达量低 毒基因 影响：宿主中质粒不稳定、抑制生长或杀死宿主（溶菌）、表达量低或无 表达 应对：严谨调控启动子，抑制本底表达 选择特殊的载体（pETcoco） 选择特定的宿主菌（BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE ） 优化培养条件与诱导表达条件 包涵体表达 1 2 3 pET28a Lane 1：Rosetta(DE3) Lane 2：BL21(DE3)pLysS Lane 3：BL21(DE3) 蛋白不可溶 成因：蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度。 定位：可溶蛋白 胞质，细胞周质，胞外（培养基） 包涵体 胞质，细胞周质 特点：可溶蛋白 天然构象，正确折叠，具有生物活性 包涵体 高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解 增加可溶表达 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶……） “假”包涵体（疏水区域，膜结合等） 诱导温度 IPTG浓度 控制表达水平 融合溶解性高的标签（GST，MBP） 融合表达 细胞周质表达，胞外分泌 分泌表达 融合催化二硫键形成酶的标签 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株） 促进正确折叠 手段 原理 1 2 3 Lane 1：37℃ Lane 2：30℃ Lane 3：25℃ 1 2 pET pGEX 促进包涵体形成 目的 高浓度，高纯度 毒基因表达 免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽） 手段 胞质表达 提升表达速率（诱导温度，IPTG浓度，etc） 特定的表达载体（pET-17xb，pET-31b(+)） 蛋白纯化障碍 表达——纯化是一个完整的、密切联系的过程，蛋白纯化过程中，很多问题的根源来自上游表达 蛋白不结合，洗脱杂带多，包涵体不易溶解…… 下篇详述 纯化策略选择 亲和层析与离子交换层析 层析方法的组合与顺序 包涵体纯化与复性 下篇 蛋白纯化 根据蛋白自身特点选择纯化方案 常用实验流程 纯化策略选择 蛋白自身特点 可溶/包涵体 融合标签 表面净电荷 分子量 其它特点 可溶/包涵体 可溶蛋白 无需变性步骤 适用于亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法 包涵体 需要洗涤、变性、复性（如有需要）等步骤 适用于某些亲和层析方法（6×His·Tag）、离子交换层析 不适用于某些亲和层析方法（GST·Tag、 MBP·Tag ） 不适用于凝胶过滤层