FISH法检测石蜡miRNA说课.ppt

荧光原位杂交技术（ fluorescence in situ Hybridization,FISH ） 定义： 荧光原位杂交技术（ fluorescence in situ Hybridization,FISH ）是一种非 放射性原位杂交方法，用特殊的荧 光素标记 DNA 探针，在染色体、细 胞或组织切片标本上进行 DNA 杂交， 以检测细胞内 DNA 或 RNA 特定序 列存在与否。 FISH的基本原理 用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。 杂交所用的探针大致可以分类三类： 1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测； 2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得； 3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。 探针的荧光素标记方法： 间接标记法：是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。 直接标记法：是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 应用范围： FISH检测对被测样本没有特殊的要求。 骨髓的细胞 羊水的细胞 冰冻切片的样本， 石蜡包埋的样本 尿液样本 （获取的样本细胞也无需经过培养扩增，FISH检测可 以显示单个细胞核内） 实验步骤 试剂准备 脱蜡 蛋白酶处理 变性 杂交 细胞核染色 试剂准备： （1 ） 1×PBS ：由 10×PBS 溶液稀释而成，储存于 4 ℃； （ 2 ） 20×SSC （ pH7.0 ）：175.3g?NaCl，88.2g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/L?NaOH调pH?至7.0） （ 3 ） 2×SSC ，由 20×SSC 溶液稀释而成； （ 4 ） 25mg/ml 蛋白酶 K 消化液。 （ 5 ）变性液 (70 ％甲酰胺 2×SSC ， pH7.0) ： 4ml 20×SSC ； 8ml 蒸馏水； 28ml 甲酰胺。 每次新鲜配制。 （ 6 ）杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml ； 蒸馏水 16ml ； 甲酰胺 20ml 。 每次新鲜配制。调节 pH 前升至室温。 脱蜡 （1）二甲苯脱蜡3次，每次5min； （2）100％酒精两次，每次2min； （3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。 蛋白酶处理 （1）每个染色缸40 ml 蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40 ml 倒入Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。 （2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。 （3） 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。 （4）梯度(70%、90%、100%)酒精脱水（-20℃预冷），空气中干燥。 变性 （1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液； （2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸； （3）78℃孵育8 min； （4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2 min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2 min； （5）空气干燥。 杂交 （1）准备探针； （2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片； （3）滴10 μl 探针在切片的组织上，加盖玻片； （4）盖上湿盒盖，37℃孵育12~16 h。 杂交 杂交后水洗： （5）镊子小心去除盖玻片； （6）43℃预热杂交后水洗溶液40 ml 水洗切片15 min； （7）2×SSC（37℃）洗两次，每次10 min； （8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。 杂交 （9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。 （10）每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体（抗地高辛单克隆抗体）或FITC卵白素，室温下孵育20 min； （11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2 min。 杂交 （12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出； （13）每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，