细胞生物学荧光染色实验介绍.pptVIP

单成彬制作 五、荧光的细胞化学测定 一、实验目的 学习荧光显微镜的使用，了解荧光显微技术原理和方法，以及荧光技术在细胞化学方面的应用。 二、实验原理 荧光显微技术是利用短波光照射被射物质，以激发其发射荧光而在荧光显微镜下可以检视的方法。 荧光又可分为：自发荧光和次生荧光。自发荧光是指有些生物体受到短波光照射后，直接发出的荧光。如经紫外光照射后，叶绿体发出的红色荧光；木质素发出的黄色荧光等。次生荧光是指有些生物材料受到短波光照射后并不发光，但当它吸附荧光染料后，也同样产生荧光，这种荧光也称间接荧光。 作为荧光的激发光源可分别采用紫外，紫、蓝、绿等波段的光；而获得的荧光为紫、蓝、绿、黄、橙、红等波段的光。不同生理活性的细胞，发射荧光(或次生荧光)的能力有很大差别，不同组份对荧光染料反应产生的荧光颜色也不同，所以利用这一特性，通过荧光显微镜可以测定某些组分的含量。以及细胞的生理活性。 三、实验用品 (一)材料：洋葱 (二)用品：荧光显微镜，载玻片，镊子，烧杯等。 (三)试剂： (1) O.01％ 吖啶橙生理盐水溶液 (2) O.02％ 异硫氰酯荧光素生理盐水溶液 (3) O.Ol％ 罗丹明生理盐水溶液 (4) 荧光增白剂溶液，将荧光增白剂溶于0.4M山梨醇液中，使 浓度达到0.1％。 四、实验方法 (一)利用荧光增白剂观察植物细胞壁 植物细胞壁有强烈的吸附染料的能力，因此很多荧光染料都能着染细胞壁，但近年来最常用的还是荧光增白剂，以此来鉴别细胞壁的状况，并常用于检查原生质体细胞壁是否分解完全，以及原生质体再生细胞壁的鉴别。 1．取洋葱表皮细胞(1cm2)置于载玻片，以荧光增白剂染色5分钟，加盖玻片，荧光显微镜下观察其细胞壁。 2．取以酶液游离出来的原生质体悬液l滴于载玻片上，加荧光增白剂一滴，染色 5分钟，加盖玻片，在荧光显微镜下观察原生质体脱壁是否完全，蓝紫光激发观察。 (二) DNA分布的观察 取洋葱内表皮细胞(1cm2)置于载玻片，以0.0l％吖啶橙染色5分钟，生理盐水冲洗一次，加盖玻片，荧光显微镜下蓝光激发观察。 （三) 蛋白质分布的观察 取洋葱内表皮细胞(1cm2)置于载玻片，以0.02％异硫氰酯荧光素染色5—10分钟，生理盐水冲洗一次，加盖玻片，荧光显微镜下蓝光激发观察。 （四) 线粒体观察 取洋葱内表皮细胞 (1cm2)置于载玻片，以0.0l％罗丹明染色5分钟生理盐水冲洗一次，加盖玻片，荧光显微镜下绿光激发观察。 五、作业 分别描述DNA，蛋白质及线粒体在细胞内的分布与颜色。 实验六 细胞活力的测定 一、实验目的 学习荧光显微镜的使用，了解荧光显微技术原理和方法，以及荧光技术在细胞化学方面的应用。 二、实验原理 荧光显微技术是利用短波光照射被射物质，以激发其发射荧光而在荧光显微镜下可以检视的方法。 荧光又可分为：自发荧光和次生荧光。自发荧光是指有些生物体受到短波光照射后，直接发出的荧光。如经紫外光照射后，叶绿体发出的红色荧光；木质素发出的黄色荧光等。次生荧光是指有些生物材料受到短波光照射后并不发光，但当它吸附荧光染料后，也同样产生荧光，这种荧光也称间接荧光。 三、实验用品 (一) 材料：新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆原生质体悬液，人口腔上皮细胞。 (二) 用品：荧光显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，烧杯，牙签等。 (三) 试剂： 1．二丙酸酯荧光素溶液：取l0mg二丙酸荧光素于5ml丙酮中，将此溶液逐滴加入 5ml PH5-6生理盐水或0.65M的甘露醇溶液中，直到出现永久性乳白沉淀为止。 2．0.01％吖啶橙的生理盐水溶液。 四、实验方法 (一) 细胞二丙酸酯荧光素分解酶的活性及细胞活力的测定二丙酸酯荧光素是非荧光性的亲酯性化合物，很容易进入细胞活力较强的细胞内，由于细胞内有较强的活性酯酶而将二丙酸酯荧光素中的荧光素分解出来，从而在荧光显微镜下发出了强烈的黄绿荧光，相反活力较弱的细胞，由于酯酶的含量低，表现荧光较弱，而死亡的细胞，由于酯酶活性丧失，不能分解二丙酸酯荧光素，而完全没有荧光，具体方法如下： 1．取少许新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆表皮放在玻片上，加二丙酸酯荧光素溶液一滴，5-10分钟后，在荧光显微镜下观察，时间不宜太长，以免细胞逐渐死亡，影响效果 。 2．若着染是悬浮细胞，可将上述染色液数滴直接加入细胞培养液5分钟后，可离心收集。再用无细胞和无染料的培养液洗二次，即可收集观察。上