第五章 亲和层析ppt.ppt

第三节　亲和层析的操作过程 一、基质的活化 对基质进行一定的化学处理 （一）多糖基质的活化：溴化氰活化 、环氧乙烷基活化 （二） 聚丙烯酰胺的活化：甲酰胺基的修饰 （三） 多孔玻璃珠的活化 ：硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺－玻璃 溴化氰活化 环氧乙烷基活化 聚丙烯酰胺的活化 二、间隔臂分子（手臂） 空间位阻效应 加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长。 三、配基偶联的方法 （一）碳二亚胺缩合法 （二）酸酐法 （三）叠氮化法 （四）重氮化法 碳二亚胺缩合法 酸酐法 用ω-氨基烷基琼脂糖(或丙烯酰肼衍生物)与1%的琥珀酸酐水溶液作用，生成琥珀酰氨烷基琼脂糖衍生物(含羧基的载体)。 叠氮化法 重氮化法 ω–氨基烷基琼脂糖衍生物，在pH9.3的硼酸钠(或三乙胺)和40%(V/V)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，与对硝基苯叠氮化合物在室温反应1 h，制得对硝基苯甲酰胺烷基琼脂糖衍生物。 产品先依次用50%DMF、25%DMF和水充分洗涤，接着用0.1 mol/L连二亚硫酸钠在40~50℃还原40 min，最后在0℃、0.5 mol/L HCl溶液中用0.1 mol/L亚硝酸钠处理7 min，制得重氮盐衍生物。 将所需配基与该琼脂糖重氮衍生物偶联反应，便可制得亲和层析柱。 四、用于固定化配基的凝胶衍生物 Sepharose CNBr活化的Sepharose 4B AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 环氧活化型Sepharose 6B 五、影响吸附剂亲和力的几个因素 微环境的影响 空间障碍的影响 配基浓度对亲和力的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 （一）微环境的影响 载体和“手臂”的存在会引起离子交换作用的发生，影响亲和吸附剂的吸附特异性。 极性很低或无极性的基团则由于疏水作用的存在，也会引起非特异性吸附作用。有时则有助于亲和力的提高，加强了亲和层析的效果； 配基与载体和“手臂”氢键的相互作用可能会使其强烈缔合，从而妨碍了与配体的亲和结合。 （二）空间障碍的影响 有的亲和对两物质间原有很高的亲和力，但当其一方制成亲和吸附剂时，与相应配体的亲和力可能完全丧失。 这种现象对于亲和力低的或分子量特大的亲和对以及小分子配基更明显。 需要在载体与配基之间插入一段适当长度的“手臂” （三）配基浓度对亲和力的影响 对于低亲和力系统，为了取得较好的配体分离效果，必须提高载体上配基的有效浓度。 较高的配体浓度在亲和层析时呈现“累增效应”，即提高了亲和吸附剂的吸附能力。 （四）配基与载体的结合位点的影响 在多肽或蛋白质等大分子作配基时，由于它们具有数个可供偶联的功能基团，必须控制偶联反应的条件，使它以最少的键与载体连接，这样有利于保持蛋白质原有的高级结构，从而使亲和吸附剂具有较大的亲和能力。 （五）载体孔径的影响 载体的孔隙是配体向配基接近的运动通道。所以载体的孔径大小对吸附剂的亲和能力有决定性影响。 当配基和大分子对象的亲和力十分高(如抗原与抗体)，或是配体是很大的颗粒(如细胞器和完整细胞)，载体的多孔性就显得不很重要了，那是因为配体与配基的作用仅发生在凝胶表面。 六、亲和层析的基本操作 亲和吸附剂选择制备 上样 洗脱 亲和吸附剂的再生和保存 （一）上样 上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。 上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。 （二）洗脱 选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。 特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。 一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。 非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。 （三）亲和吸附剂的再生和保存 再生就是指使用过的亲和吸附剂，通过适当的方法使去除吸附在其基质和配体（主要是配体）上结合的杂质，使亲和吸附剂恢复亲和吸附能力 一般情况下，使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。 亲和吸附剂的保存一般是加入0.01%的叠氮化钠，4℃下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。应注意不要使亲和吸附剂冰冻。 第四节 亲和层析的应用 ①提取、分离、纯化、浓缩各类生物分子； ②分离纯化各种功能细胞、细胞器、膜片段和病毒颗粒； ③用于各种生化成份的