第四章细胞工程制药技术ppt.ppt

第四章 细胞工程制药技术 第一节 概述 细胞工程 动植物组织和细胞培养技术 细胞融合技术 细胞器移植技术和细胞重组技术 体外受精技术 染色体工程技术 DNA重组技术 第二节 细胞融合技术 三、植物原生质体融合和体细胞杂交 植物原生质培养和细胞融合可用产生远缘杂种； 是目前植物细胞及基因工程的核心技术。 自1970年首次获得烟草原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余种，其中有20种为我国首先报道。 原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。 四、微生物原生质体融合 （一）标记菌种筛选和稳定性鉴定 营养缺陷型菌株 选择性培养基 高渗溶液保存杂种细胞增加稳定性 （二）原生质体制备与再生 制备原生质体的方法： 超声波破碎法 酶法：加溶菌酶42℃轻轻震荡45分钟即形成原生质体，然后取0.1mL涂布培养于琼脂培养基，由于渗透休克很少形成菌落，菌落越少说明原生质体化效果愈好 原生质体再生： 复原再生培养基DPA加1mL原生质体悬浮液，再加0.1%琼脂的高渗培养基混合重组在基础培养基上，在30℃培养3~4天，可获得约1%~10%的复原再生菌落。 （三）原生质体融合 取A株和B株原生质体悬液各1 mL 混合，放置5 min 后，2500 r/min 离心10 min，弃上清液。于沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混匀，再加入1.8 mL PEG 溶液，轻轻摇匀，置36℃水浴保温处理2 min，2500 r/min 离心10 min，收集菌体，将沉淀充分悬浮于2 mL SMM 液中。再取少量最后稀释液涂布在复原再生培养基上培养并观察重组菌株。 原生质体稳定液(SMM)： 0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgCl 、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。 （四）融合重组体的检出 直接法 间接法：影印法 3. 细胞壁再生及细胞分裂： l-3天即再生新细胞壁，表现为体积增加、膨大，再由圆变椭圆。可用质壁分离法证实。也可用0. 1% ST型或WBL型荧光增白剂染色，经前者染色，有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧光。经后者染色，有细胞壁者发射绿色荧光。 在原生质培养过程中，胞质增加，液泡减少，叶绿体或颗粒内含物分散于泡质中或围绕于细胞核周围．常在1一2周内发生第一次分裂。不同细胞分裂频率不同。 4、愈伤组织或胚状体形成 原生质体再生的细胞一旦开始分裂，就可能继续生长： A 形成细胞团，发育成愈伤组织； B. 形成胚状体，再产生植株； C. 形成愈伤组织，再形成胚状体。 随着细胞分裂及细胞团形成，已与常规细胞和组织培养相同，故培养3—4周需添加含一定量低渗稳定剂的新培养基，以满足细胞的营养，亦利于细胞团及小愈伤组织的生长。 5. 植株再生 大多经愈伤组织诱导分化再生为完整植株。当愈伤组织达到1—2mm时，转移至分化培养基上诱导器官分化。分化培养基与原生质体培养基差别在于： (1) 只用蔗糖为碳源，不加渗透稳定剂； (2) 与原生质体培养基相反，细胞分裂素浓度高于生长素; (3) 在诱导器官分化过程中，一般采用15001x左右的高光强。诱导器官分化的温度与原生质体培养基本相同。 （三） 原生质体培养的目的： 1、利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取，原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞(即体细胞杂交）。 2、是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。 3、也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。 A-E, 培养的欧当归(Levisticum officinale Koch))原生质体分裂再生成植株的过程 F-L, 培养过程的核变化；F.多核，G.核穿壁，H.无丝分裂，I.染色体桥，J. 2n=22，K.L.多倍体. A-D当归(Angelica sinensis(Oliv) Diels)原生质体培养成再生苗 E-H,红豆草(Onobrychis vicaefolia Scop) )原生质体培养再生植株 （四）原生质体融合： 在外界因素作用下，两个或两个以上植物细胞合并成一个多核细胞的过程称为植物细胞融合，或植物体细胞杂交。但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，不能直接融合，需经酶消化除去细胞壁释放出原生质体，后者生理、生化及遗传学特性与完整细胞基本相同。在适当条件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用，并可再生细胞壁，形成完整植株。 1、作用： (1) 可实现远缘杂交，获得种间杂种