第二章 基因工程制药综述.ppt

三、基因工程菌的发酵工艺 基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：（1）生物材料方面（2）生产目的方面 1、培养基的影响 常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。 另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。 培养基及灌注式细胞培养袋 2、接种量的影响 接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。 3、温度的影响 温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。 在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA讲解和翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表。 温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。 4、溶解氧的影响 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。 通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 5、诱导时机的影响 一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。 6、pH的影响 pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。 总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。 四、基因工程菌的培养设备 发酵罐的组成部分有：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统以及培养液配置及连续操作装置等。 第七节 基因工程药物的分离纯化 许多医药生物技术产品都是活性肽或蛋白质。这些产品的制备具有下列特点： （1）目的产物在初始物料中含量较低 （2）含目的产物的初始物料组成复杂，且影响较大 （3）目的产物的稳定性差 （4）种类繁多 （5）应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等。 因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。 一、建立分离纯化工艺的依据 1、含目的产物的起始物料的特点：包括 （1）菌种类型及其代谢特性 （2）原材料和培养基的来源及其质量 （3）生产工艺和条件 （4）初始物料的物理、化学和生物学特性。 2、物料中杂质的种类和性质 3、目的产物特性 4、产品质量的要求 二、分离纯化的基本过程 分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过4～5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。 重组蛋白表达及分离纯化技术平台 基因工程药物分离纯化生产装置 三、分离纯化的技术 分离纯化技术应满足下列要求：（1）技术条件要温和（2）选择性要好（3）收率要高（4）两个技术之间要能直接衔接（5）整个分离纯化过程要快 1、细胞破碎与固液分离：有细胞收集、细胞破碎和细胞碎片分离等步骤。 （1）细胞收集：细胞收集常用的是离心分离的方法，膜过滤法液逐步得到广泛应用。 （2）细胞破碎：有机械破碎法和非机械破碎法。 机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法 非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。 （3）固液分离：离心沉淀是固液分离的主要手段，包括高速离心和超速离心。常用的膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等。 2、目的产物的分离纯化 主要依赖色谱分离方法。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱。亲和色谱、凝胶色谱、高压液相色谱等。 蛋白质纯化方法的设计通常根据产物分子的物理、化学参数和生物学特性，他们对分离纯化的影响见表3—3。 选择纯化方法应根据目的蛋白质和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。 （1）离子交换色谱（ion exchange chromatography,IEC）基本原理是通过带电的溶质分分子与离子交换剂中可交换的离子进