实验四绿豆种子的灭菌与接种.ppt.pptVIP

* * 实验四 绿豆种子的灭菌与接种 一、实验目的： 1. 掌握接种的方法 二、实验原理： 用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。 在组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。 离体器官或组织受到适当刺激，便可进行器官分化，从而实现细胞的全能性。 三、实验用品： 1.实验材料：绿豆种子 2. 实验器材：超净工作台、镊子、酒精灯、烧杯、培养皿 3. 实验试剂：酒精、次氯酸钠、无菌水、绿豆种子、培养基 四、实验方法与步骤 准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。 2. 将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，同时打开接种室内的紫外灯，用紫外灯照射至少25分钟，然后关室内的紫外灯，开送风开关，关闭台内的紫外灯，通风十分钟后，再开日光灯进行无菌操作。 3. 接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。 4. 将绿豆种子在流水下冲洗干净。 5. 将种子放于200 ml的广口瓶中，用70%的酒精溶液浸泡30 s，无菌水冲洗，然后用2%次氯酸钠溶液（加入吐温2滴）浸泡10 min，期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤5遍待用。 6. 解除三角瓶上捆扎的线绳，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用75%酒精擦洗接种台表面。 7. 接种用的镊子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷却。 8. 在酒精灯火焰旁揭去封口膜，将瓶口倾斜接近水平方向，用火焰灼烧瓶口，灼烧时应不断转动瓶口（靠手腕的动作，使试管口沾染的少量菌得以烧死），左手持瓶，使其靠近火焰，右手将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，夹取绿豆种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放4-6个外植体。 9. 转动瓶口灼烧，将封口膜从酒精灯火焰上过一下，盖上封口膜，扎好绳子，标上接种日期、材料名称、姓名等。 10. 将接种材料移到培养室培养 五、注意事项 从室外取得材料，要用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，冲洗时间要长，必要时要用毛刷刷洗。 2. 外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力、灭菌剂的去除等因素，最好选用两种消毒剂交替浸泡，初次实验灭菌时间要设置一定的时间梯度来确定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂的见上表。 3. 工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作（比如说、笑、打喷嚏），以免影响气流，造成污染。另外操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。 4. 接种前培养基出现大量污染现象，若菌类只存在于培养基表面，且主要是真菌时，可能是因培养瓶密封不严或放置培养基的环境不洁净，菌类种群密度过大所致。若菌类存在于培养基内部，则可能是由使用污染的贮藏母液引起。另外培养瓶不洁净，灭菌不彻底也是导致接种前培养基污染的原因。避免此现象发生的方法是：保持环境洁净，杜绝使用污染的母液，严格高压蒸汽灭菌程序，保证灭菌时间。 5. 接种后培养基出现大面积污染、菌落分布不匀，此种情况主要是接种过程中发生的污染所致。可能是接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台。出现故障等原因引起。避免此现象发生的方法是：保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌；在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20~30 min；用75%酒精喷雾杀菌降尘，超净台开启15~20 min后方可使用；镊子等接种工具严格彻底灭菌，且接种时使用1次灭菌1次；操作过程中经常用75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施。 6. 接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法是：外植体用饱和洗涤剂浸泡10~15 min，自来水冲洗0.5~2 h后，再选择适宜的灭菌剂消毒，一般用0.1-0.2%升汞灭菌最好。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温-80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。 六、思考题 1. 接种时，对外植体的要求有哪些？ *