实验二淀粉酶活性的测定重点剖析.pptVIP

生物化学实验 实 验 二 淀粉酶活性的测定 一、实验目的： 1、学习并掌握植物体内淀粉酶活性测定 的原理和方法。 2、掌握α，β-两种淀粉酶的理化特性。 二、实验原理: 淀粉是植物生长期间以淀粉粒形式存在于细胞的储存多糖。种子、块茎、块根器官含量丰富。 天然淀粉含两种组分：直链和支链淀粉。多数淀粉含直链与支链淀粉的比例(20％－25％)：(75％－80％)。 本实验采用加热法钝化β-淀粉酶，测定α-淀粉酶的活性。具体方法是利用3,5-二硝基水杨酸比色法来测定淀粉酶水解生成的麦芽糖的含量，以单位时间淀粉酶分解生成麦芽糖的量来表示淀粉酶活性的大小。 在碱性，加热条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS) 反应，还原糖被氧化成糖酸， DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。 三、实验材料、仪器和试剂： 1、实验材料：萌发的小麦种子 2、仪器：(1) 可见分光光度计 (2) 恒温水浴锅 (3) 离心机 (4) 刻度试管 3、试剂：(1) 0.4M NaOH； (2)1%淀粉； (3) 3,5-二硝基水杨酸； (4)麦芽糖标准溶液(1mg/ml)。 2、酶液的制备 ： 称取2.0 g萌发的小麦种子 →于研钵中，加2ml水及少许石英砂，研成匀浆→转入离心管→用6ml蒸馏水分三次洗涤研钵→均转入离心管→用玻璃棒搅动20min→等重→ 4000r/min离心10min→上清夜转入100ml容量瓶→定容，此提取液即为淀粉酶液。 3、α-淀粉酶活性的测定： （1）取两支试管一支对照，一支测定→各加淀粉酶液1ml→70℃准确加热15min→冷却→向对照管加4ml 0.4M NaOH，终止酶活性； （2）测定管和对照管于40℃水浴15min→均加入2ml 40℃预热的淀粉→立即40℃水浴保温5min→取出后迅速向测定管加入4ml 0.4M NaOH； （3）取对照管和测定管中溶液各2ml,分别加入到刻度试管中→各加2ml 3,5-二硝基水杨酸→沸水浴5min→冷却→稀释至20ml刻度→混匀→以制作麦芽糖标准曲线的1号试管为参比溶液，调“零”，测定540nm处吸光度→记录结果。 五、实验结果与计算： 在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg/ml），按下列公式计算α-淀粉酶和β-淀粉酶的活力。 α-淀粉酶活力（麦芽糖毫克数/样品鲜重?分钟） =（ A2-A1）×V×D÷样品鲜重÷时间 其中：A2：为α-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml） （测定试管中麦芽糖浓度）； A1：为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）。 V：为酶促反应体积； D：为稀释倍数。 * Please be quiet, 上课了！！ 学时：3 生物化学实验 二、实验原理 酶（enzyme） 是具有高效性与专一性的生物催化剂（biological catalyst）。 绝大多数酶的化学本质是蛋白质。 特点： 1、酶具有高效性（high catalytic power） 2、酶具有专一性（specifity） 二、实验原理:酶活性（emzyme activity） 指酶催化特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下酶促反应速度来表示，酶促反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。 NRE RE 直链淀粉 直链淀粉的螺旋结构 0.8nm 1.4nm 6个残基 RE NRE ?(1-6)分支点 支链淀粉或糖原分子示意图 支链淀粉或糖原分支点的结构 β-淀粉酶断裂 产生游离麦芽糖 RE NRE ?(1-6)分支点 支链淀粉或糖原分子示意图 β-淀粉酶断裂 产生游离麦芽糖 淀粉酶能催化淀粉水解为麦芽糖。 植物中淀粉酶有两种，各有其不同的理化特性。 α-淀粉酶耐热不耐酸，70℃加热15min仍保持活性,pH＜3.6时钝化。 β-淀粉酶耐酸不耐热，70℃加热15min则钝化。 据此钝化其中之一，即可测出另一种酶的活性。 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色,A540) 3,5-二硝基水杨酸 (DNS) 四、实验步骤