第五章-药用植物原生质体培养.pptxVIP

第五章 原生质体培养与体细胞杂交;教学内容; 原生质体（Protoplast）概述; 1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。 1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。;　据统计，目前全世界已有49个科，160个属的367种植物经原生质体培养得到了再生植株。其中成功报道最多的是茄科，其次是豆科、禾本科、菊科、十字花科、伞形科等。 我国的发展概况： 原生质体培养的再生植株:烟草、胡萝卜、矮牵牛 原生质体融合：小麦×蚕豆、小麦×玉米、水稻×豌豆 ;第一节、原生质体分离及纯化;多数植物分离原生质体的经典材料－叶肉细胞 温室生长的植物，叶片干净幼嫩，是较好的材料来源。 无菌苗的叶片更具优势。 上胚轴和子叶;材料预处理;;1.2.1 机械分离法（Mechanical isolation）;机械分离法的优缺点;;酶分离法使用的酶;酶;酶;酶液的配制;酶解液的组成及浓度 酶的混合液 　纤维素酶（1%-2% 浓度）、果胶酶（0.2%- 0.5%浓度）等。 渗透稳定剂　促进酶解，保持原生质体的完整性。 　甘露醇、山梨醇、葡萄糖等， 适宜的浓度为450-800 mmol/L。 盐类　增加膜的透性（氯化钙、氯化镁）。 ;酶组合、浓度;材料;酶解法分离原生质体;酶解法分离原生质体;原生质体分离(一步分离)过程图示 （以叶片为例）;原生质体的分离步骤 （一）取材（叶肉细胞） 充分展开的嫩叶。 洗涤、消毒、无菌水冲洗。 对禾本科植物叶片消毒时，使用苄烷铵（Zephiran）（0.1%） - 酒精（10%）溶液漂洗5分钟效果最好。 ;（二）酶解 材料→ 撕掉下表皮→ -修剪成2cm见方小块 → 置于6cm直径培养皿中(下表面朝下0.5g) → 加2ml酶解液→置于25-27℃下保持3-4小时左右→轻轻震荡→原生质体释出。;酶解法的优点 （1）能够容易地大量地得到原生质体 （2）条件温和，完整性好，有活力。 （3）几乎可以从任何组织（只要细胞还没有木质化）分离出原生质体。 现为最常用的进行原生质体分离的方法。;影响酶活性和酶解效果的因素 PH值：4.7-6.0之间 温度：植物所需温度为25-30 ℃ 时间：30分钟-20小时 用量：1g鲜组织用10ml酶解液的效果很好。;2. 原生质体纯化与活力测定;原生质体纯化方法;2.1.1 离心沉淀法;离心沉淀法;2.1.2 漂浮法;叶肉原生质体分离纯化（漂浮法）;优点： 可以减少分离的原生质体因离心被组织碎片撞击而破损情况的发生。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。;纯化后的叶肉原生质体;2.2 原生质体活力测定;染色识别法 0.1%酚番红或伊凡蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。 双醋酸盐荧光素（FDA，0.01%）染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。 ;第二节 原生质体培养; 碳源：葡萄糖 氮源：谷氨酰胺 生长物质：生长素与细胞分裂素 钙源：CaCl2可增强稳定性，提高分裂频率，明显改变细胞质内外的离子交换。 渗透压：高渗溶液，通常的渗透剂是甘露醇和山梨醇，调节渗透压。 pH ：5.6～6.0;2. 培养方法;2.1 液体浅层培养;液体浅层培养的优缺点：;2.2 平板培养;优点： 原生质体处于固定位置，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察 缺点： 通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。 ;2.3 双层培养法（固、液培养）;优点： 固相培养基可以补充液相培养基的营养；固相中如果加入活性炭，可吸收培养物释放的有毒物质。 缺点： 不易观察细胞的发育过程。;X-射线杀死某种植物细胞中的核，但细胞可正常代谢，与0.7%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层（固体），再将要培养的生活力正常的原生质体与0.7%琼脂混合（液体），培养于饲养层上。;2.5 微悬滴法培养 　方法：吸取原生质体的悬浮液，滴于6cm直径的培养皿的盖上，液滴大小 20-50μl左右，悬滴培养。原生质体在液滴的中央生长。 　为了防止培养基迅速蒸发，可以在培养基的底皿里加液体培养基保湿。;3. 培养条件 　KM-8p培养基，25℃－27℃，最初两周暗培养（壁的形成和细胞再生）；分化时补充光照培养（光