高等生物化学概念.ppt

;3. 离子交换层析; 一些常用的纤维素离子交换剂Sephadex离子交换剂;离子交换层析;（五）利用选择性吸附的纯化方法 ;2. 疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC） ; 1)原理;蛋白质等生物大分子与HIC介质的结合不仅取决于分子疏水性表面的比例，还与疏水补丁的分布有关; 一般来说每个分子被吸附的过程都会有1个配基参与，换句话说，分子在介质上发生的结合是多点结合。;疏水层析与反相层析RPC的区别 ：;蛋白质种类 ;疏水作用层析过程的参数 ;2）介质（基质+配基）;HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，与RPC介质相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基 ;;;常用商品化疏水层析介质;Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，配基结合量为40 μmol苯基Phenyl/ml ，工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h 。 Phenyl Sepharose CL-4B 疏水性较Octyl弱，适用于分离和纯化对疏水性尚未了解的蛋白，配基结合量为40 μmol苯基Phenyl/ml ；工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是50cm/h 。;3）技术;①介质的选择;不同的介质对同一样品有不同的分离效果;②样品的准备;样品的加量问题;③层析条件的优化;流动相A与流动相B ;? ;;起始流动相条件的影响;;洗脱的方式 ;; 温度升高会增加疏水作用，但注意蛋白质等生物大分子在较高温度下会变性。对特定的分离，操作温度需保持恒定，才能确保层析结果具良好的重复性。 ;④层析介质的再生、贮存 ;4) 应用;;;Phenyl-Sepharose疏水作用层析条件： 柱尺寸为20×1cm，4℃样品缓慢添加硫酸铵达30%饱和度，轻搅2h，层析柱先用含30%硫酸铵的100mmol/L的乙酸钠缓冲液（pH6.5）充分平衡，将样品加入柱中，用200mL上述含30%硫酸铵的缓冲液清洗层析柱，用线性下降的盐浓度梯度洗脱，300ml内从含30%硫酸铵的100mmol/L的乙酸钠缓冲液连续过渡到不含硫酸铵的100mmol/L的乙酸钠缓冲液。;;;;; 与HIC相关的其它层析技术也得到了发展，主要有： 亲硫性疏水层析 (thio—philic chromatography) 疏水电荷诱导层析(HCIC)