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第三章 基因工程制药 学习要求： 掌握基因工程药物生产的基本过程，掌握真核生物目的基因分离的原理和基本方法，掌握常用的原核、真核表达系统的特点以及影响药用目的基因表达的主要因素，熟悉导致基因工程菌不稳定的原因及解决方法，掌握基因工程菌的发酵工艺和基因工程药物分离纯化方法的基本原理及技术。 8学时。;重组DNA技术的理论基础 19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学 20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学 1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA 分子遗传学 1953年 沃森--克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学 1973年 伯格--杰克森--考恩--鲍耶 DNA分子体外拼接 基因工程 ;重组DNA技术的基本定义 将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。;重组DNA技术的操作过程 ;基因工程的基本定义 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建技术（即重组DNA技术）；而下游技术则指基因工程菌或细胞的大规模培养技术及目的基因产物的分离纯化技术。;基因工程的基本用途 分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源。 设计、构建生物的新性状甚至新物种。 大规模生产生物活性物质。 ; 传统制药存在的问题 A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来源困难而供不应求； C、由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。 基因工程技术的特点 能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。;基因工程药物的主要种类 1、免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体； 2、细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、表皮生长因子、凝血因子； 3、激素，如胰岛素、生长激素、心钠素； 4、酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。 ;基因工程技术生产药物的优点 1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障； 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； 3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 4、内源生理活性物质作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程进行改造和去除; 5、利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 ;基因工程药物生产基本过程 获得目的基因 构建重组质粒 构建基因工程菌（或细胞） 培养工程菌 产物分离、纯化 产品加工、检验等 ;上 游 阶 段 首先获得目的基因，然后用限制性内切酶和连接酶将其插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其它宿主菌（细胞），以便大量复制目的基因。 选择基因表达系统主要考虑的是保证表达功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。;下 游 阶 段 将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。;目的基因的获取途径;TTTTTT;反转录人工合成互补DNA;2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。 3、cDNA第二链的合成： 4、cDNA cloning：expression vector pUC 5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的转录方向、起始点等。） ; 化学合成法 前提：较小的蛋白质或多肽的编码基因，必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA