谷氨酸生产菌的选育资料.pptVIP

谷氨酸生产菌的选育;谷氨酸生产菌的选育方法，主要是采用常规的诱变育种及遗传工程技术构建工程菌株。;诱变育种;诱变育种包括诱变和筛选两个部分：首先，以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液，在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA结构用适宜的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。;诱变育种的基本流程;谷氨酸生产菌的诱变育种流程;在诱变育种实践中，为了获得协同效应，常常采取诱变剂进行复合处理，可以是两种或多种诱变剂的先后使用，或是同一种诱变剂的重复使用，或是两种或多种诱变剂的同时使用。;出发菌株ASL299→菌悬液制备→硫酸二乙酯诱变→单氟乙酸平板筛选→高糖平板筛选→高谷氨酸平板筛选→摇瓶筛选→DES突变株→原生质体制备→紫外线诱变→原生质体再生→香豆素和氯化锂平板筛选→谷氨酸为唯一碳源平板筛选→摇瓶筛选→UV突变株→稳定性试验→生产条件试验;谷氨酸菌诱变选育操作步骤;（3）单氟乙酸平板筛选 将诱变的菌悬液涂布在含0.5%单氟乙酸的平板上，在32摄氏度的条件下避光培养36—48h,挑取生长良好的菌落。 （4）高糖平板筛选与高谷氨酸平板筛选 将抗单氟乙酸的菌株涂在含25%葡萄糖的平板上，培养48h后，挑取生长良好的菌落，可得到耐高糖菌株。然后，将耐高糖菌株涂在含20%谷氨酸的平板上，培养48h后，挑取生长良好的菌株，即得到耐高谷氨酸菌株。 （5）摇瓶筛选 将突变株接入摇瓶发酵培养集中，进行摇瓶发酵，比较菌株的谷氨酸产量，选出谷氨酸高产菌株。 ; (6)原生质体制备 将DES突变株的斜面菌接入一级种子培养集中，32摄氏度振荡培养5h，加入青霉素G，使青霉素G的浓度为0.6U/ml，继续培养3h，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤2次，将菌体与高渗稳定液混合，于装有玻璃珠的无菌三角瓶充分振荡，制成菌体的高渗悬液，调节菌体浓度为（1-3）× 个/ml。然后，加入溶菌酶，使其浓度为200-800U/ml，恒温32摄氏度振荡处理，镜检观察原生质体的形成情况，当95%以上的细胞变为原生质体时，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤2次，最后制成??生质体的高渗悬液。取1ml原生质体悬液，用无菌水稀释后涂布于完全培养基上恒温28摄氏度培养72h，以霉检前的菌悬液为对照，根据在平板上形成的菌落数计算原生质体形成率，计算公式如下：原生质体形成率= ;(7)原生质体的紫外线诱变 取5ml原生质体悬液放入已灭菌的9cm的培养皿中，采用15W，波长为253.7nm左右的紫外线灯进行照射，照射距离为30cm，照射时间为20-40h。照射过程采用电磁搅拌以使照射均匀。 (8)原生质体再生 紫外线诱变后，用高渗稳定液对原生质体悬液进行适当稀释，吸取0.1ml涂布于下层固定体再生培养基上，再加入上层固体再生培养基，轻微摇匀，双层平板法于28摄氏度培养72h。取1ml原生质体悬液，用高渗稳定液稀释后涂布于下层固体再生培养基上恒温28摄氏度培养72h。更具在平板上形成的菌落数计算原生质体再生率，原生质体再生率= ;（9）香豆素和氯化锂平板筛选 挑取再生菌落涂在0.15%香豆素和0.5氯化锂的平板上，在32摄氏度的条件下培养48h后，挑取生长良好的菌落。 （10）谷氨酸唯一碳源平板筛选 用牙签法将抗维生素P类衍生物菌株接到以谷氨酸为唯一碳源平板上，在32摄氏度的条件下培养48h后，挑取省长微弱或不声张的菌株，即为不利用谷氨酸的菌落。;（11）摇瓶筛选与稳定性试验 经谷氨酸为唯一碳源平板筛选后，再对所选菌株进行筛选，选出谷氨酸产量最高的菌株。然后，将其连续进行斜面传代10次，对每代菌种都进行摇瓶试验，比较各代菌种的谷氨酸生产能力。如果谷氨酸生产稳定，则该菌株可用于生产条件试验。 ;The end