第五章亲和层析分离技术分析.ppt

第五章 亲和层析技术 利用生物大分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和层析分离技术 简介——亲和配基 亲和层析的理论 对正常的凝胶过滤色谱而言 亲和层析的理论 亲和层析的理论 实际上，Ve’/Ve很难测定，但在洗脱液中，加入可活性配基或竞争性抑制剂，使固定配基的表边的亲和力降低，其数值可以测得 亲和层析的理论 推导得到 溴化氰法 三嗪法 高碘酸盐法 环氧化物法 苯醌法 其他方法——甲苯磺酰氯 戊二醛法 N6（6-氨己基）氨甲酰-AMP-Sepharose间接偶联法示意图 染料亲和层析 染料亲和层析 染料亲和层析 染料配基和蛋白质作用大小排列 原理 （a）吸附过程；（b）洗脱过程；（c）再生过程 引入硫醇基 引入双硫键 核苷酸及辅酶亲和层析 核苷酸及辅酶亲和层析 核苷酸亲和层析的合成 碳二亚胺直接法偶联 间接偶联法 核苷酸亲和层析的吸附和解吸 5.4.2 固定化金属离子亲和层析 螯和基团和金属离子的选择 亲和层析介质的合成 固定化金属离子亲和层析的 吸附和解吸条件 5.4.3 染料亲和层析 染料亲和层析介质的制备 蛋白质的吸附和解吸 Cibacron Blue F3G-A 结构图 其中R为: Procion Red H-E3B 结构图 Procion blue H-ERD Procion Green H-E4BD Procion Red H-3B Procion Blue MXG Procion Organge MX-2R Procion Red MX-7B Cibacron Blue F3-GA Procion Red H-E3G Remazol Blue R Procion Yellow H-E6R Cibacron Brown 3-GRA Procion Red MX-4R Procion Yellow MX-4R Remazol Organe R Procion Blue MX-7RX Cibacron Blue 2-RA Procion Yellow MX-6G Remazol Organe 3R 第五组 第四组 第三组 第二组 第一组 5.4.4 免疫亲和层析 免疫亲和层析介质的制备 免疫亲和层析的吸附和解吸 多数专一性高 可高可低 亲和专一性 低 高 抗体质量 短 长期 提供的持久性 中等 大 抗体数量 少 多 手工时间 简单 多 设备需求 多抗 单抗 比较项目 免疫亲和层析 单抗和多抗的比较 5.4.5 基团专一性大分子亲和层析 Protein A 亲和层析 Ig G抗体 解吸：1M acetate buffer 0.1 M glyceicine HCl buffer Con A 亲和层析 糖蛋白：免疫球蛋白，IgM 低密度酯蛋白 肝素亲和层析 5.4.6 共价色谱 共价介质的合成 * * 北京化工大学 谭天伟教授 亲和层析技术 5.1 简介 5.2 亲和层析理论 5.3 亲和层析介质活化 5.4 常见底亲和层析技术 5.1 简介 单专一性的小分子配基 基团专一性小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基 基因专一性的大分子亲和配基 较低 最低 较低 高 成本 高，可用浓或处理 高 高 较差，易变性 再生及稳定性 中等 高 高 低，0.1-1.0%配基利用 吸附容量 容易 化学 交联容易 容易 中等 解吸难易 对氧化物 直接吸附或 环氧化物 很多 配基交联技术 较高， 取决于吸附条件 中等 较高 很高 专一性 HLAC DLAC IMAC 拟生物专一性配基亲和层析 生物专一性（AC） 参数 不同亲和层析分离方法的比较 简介——亲和洗脱 亲和洗脱是和亲和吸附（Affinity Adsorption）对应的，即利用在洗脱液中加入和吸附目标蛋白有专一性的物质，而只将目标分子解吸下来。亲和洗脱可用于亲和层吸，也可以用于普通的层析如离子交换等的解吸。亲和洗脱一般采用和目标分子具有识别性的小分子或类似物。 亲和层析分离技术 亲和层析的理论 亲和介质的制备 常见的亲和层析 5.2 亲和层析的理论 当蛋白质在非凝胶相和凝胶相之间达到平衡 亲和色谱中，固定配基在蛋白和凝胶之间产生的额外亲和作用 在可溶性亲和竞争性配基的存在下，固定配基对酶的阻滞作用降低，其程度取决于可溶性配基和固定配基的相对浓度和解离常数。 5.3 亲和介质的制备 介质的选择 介质的活化和偶联 亲和配基固定偶联的密度的测定 间臂分子的选择 介质的选择 通常而言，亲和