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第二章 微生物学经典技术 课程标准 本章要点 第一节 显微技术 第二节 无菌技术 第三节 分离技术 第四节 培养技术 返回总目录 第二章 微生物学经典技术 Classical Technique of Microbiology 课程标准 了解微生物学显微技术、无菌技术、分离技术、培养技术等四大经典技术的发展历程，掌握四大经典技术所涉及的方法。 一. 显微技术(Microscopical Technique) 二. 无菌技术(Aseptic technique ) 三. 分离技术(Separate Technique) 四. 培养技术(Culture Technique) 本章要点 微生物最根本的特殊性就是它们微小 第一节 显微技术 Microscopical technique 1 显微镜技术的发展 2 光学显微镜样品的染色方法(Dyeing methods ) 3 电子显微镜样品的制备 Optical Microscope, OM Electron Microscope, EM 工具是人类器官的延伸。要观察肉眼看不到的微生物，没有适当工具是不可能的。在列文虎克用显微镜揭示微小的生命世界之前80多年，已经有人制造出显微镜，并描绘了显微镜下细菌的形态。不过，看到细菌、原生动物等活的微生物，并把它们的运动记录下来的第一人是列文虎克（Anthony Van Leeuwenhoek)。 1 显微镜技术的发展 Development of Microscope technique 随着工业发展和技术进步，显微镜经过300多年的改进，现在已经是林林总总，形式多样了。但从功能上说，无非是从器具和观察对象两方面着手提高放大倍数和增加分辨细微结构的能力。 器具 观察对象 提高放大倍数 增加分辨细微结构的能力 器具 观察对象 光波只能对大于其波长的物体造象 可见光的波长大约是0.4—0.8微米，所以光学显微镜不可能分辨小于200纳米（0.2微米）的物体。D=0.5 λ/NA 目前的光学显微镜放大和分辨效率已经越来越接近其极限，大约可以将对象放大2000倍。 由于一般细菌的直径大约是1微米，所以在光学显微镜下，只能观察细菌的一般形态和主要的细胞结构，即使较大的细菌，也不能有效地研究它们的内部细微结构。 不仅可以看到细胞中许多细微结构，还能观察分子的形态。 电磁波的波长约是0.005纳米，是可见光波长的十万分之一 电子显微镜的放大倍数目前可以达到百万，可以分辨0.1—0.5纳米，也就是说，物体中相距0.1—0.5纳米的两个点也可以分辨清楚。 激光技术和计算机技术的发展 显微镜的不断革新 后来发现细胞可以用染料染色，而且不同的细胞结构对染料有特异性反应，甚至不同种类微生物对同种染料的着色情况也不同。 2 染色方法Dyeing Methods 为了提高观察效果，被观察的对象也要进行处理。 开始，微生物学家在用光学显微镜观察细菌的时候，由于悬浮在液体中的细胞既微小又透明，观察起来非常困难。 染色方法的种类 简单染色法（Simple staining) 复合染色法（复染法）(complex staining) 用两种或两种以上的染料对菌体或菌体的不同结构进行染色 用一种染料对菌体进行染色 最著名的例子是丹麦科学家革兰（Chriatian,Gram）在1884年发明的一项重要的观察细菌的方法-革兰氏染色法 这种目前仍然广泛使用的革兰氏染色反应对于细菌的鉴定具有很高的价值，而且后来发现根据这个染色反应区分的革兰氏阳性细菌（能够保留染料，故细菌呈紫色）和革兰氏阴性细菌（不能保留染料而被番红花红染成红色）在许多生理特性上有区别，例如革兰氏阳性细菌对青霉素和磺胺类药物特别敏感。现在知道这是因为两类细菌的细胞壁有很大的差异。 这个方法是把细菌涂在载玻片（slide)上，在酒精灯上烘干，用结晶紫染色，再用碘液处理，然后用酒精浸洗，看细胞是否能保留染料。结果发现有些细菌能保持紫色，另一些却褪色. 正染色法(Positive staining) 负染色法(Negative staining ) 对菌体或菌体内的结构进行染色 对背景进行染色，而菌体无色 紫色染料 嗜酸染色法（Eosinophilic staining）识别引起麻风的分支杆菌 麻风分支杆菌 印度墨汁染色细菌荚膜 细菌荚膜 孔雀绿染细菌芽胞 芽胞 除了用各种染料染色样品以便清楚地观察微生物外，还可以用各种发荧光的物质来染色微生物样品。例如现在可以用一种荧光染料来区分革兰氏阳性和阴性细菌。 电子显微镜观察样品的方法很多，基本上可以分为透射型和扫描型两类。前者是电子流通过观察样品而形成图象；后者则是用来观察微生物的表面细节，分辨率大约在7纳米左右。 3 电镜样品的制备方法