第九章植物花药和花粉培养要点.pptVIP

第九章 植物花药和花粉培养 花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。 9.1 植物花药和花粉培养的概念 花药中（或花粉）小孢子的雄核发育，产生植物单倍体（haploid），进而可以通过染色体加倍产生加倍单倍体（double haploid，DH）。 双倍体植株 单倍体胚 单倍体植株 两者的异同点 相同点： 培养目的相同，均获得小孢子植株。 不同点： （1）花药培养离体操作技术简单，而且，药壁组织有时可作为条件因子促进小孢子的发育。 辣椒花药 吊竹花粉粒 花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。 （2）花药培养属于组织培养；而花粉培养属于细胞培 养。 辣椒花药 吊竹花粉粒 9.2.1 花药培养 1）取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。 2）预处理 低温（接种前3~20℃或接种后6~10℃ ）；γ—射线和激光；高温预处理 （接种后32~35 ℃ ）；等方法 9.2 花药和花粉培养方法 3）消毒 70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。 4）培养 固体、液体与条件培养。 先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。 图9-3 小麦花药愈伤组织（左）及芽、根的分化（右）（引自陈耀锋，2002） 与花药组织培养相比，花粉培养具有以下优点： 花药培养产生的植株并不都是起源于花粉，容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生的植株中会出现不同倍性的个体，所以花药培养在诱导单倍体方面有一定的局限性，而分离的花粉粒培养可以克服这一不足。 由于去除了药壁和其它连接组织的干扰，因此能更好地调节控制雄核发育的各种因子，而且能直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程。 9.2.2 花粉培养 花粉是真正的单细胞单倍体，花粉群体的所有小孢子在培养条件下均能匀质地接受各种化学的、物理的因子处理，是突变体筛选及外源基因导入研究的有用材料，对育种有很大的意义。 花粉群体大，一个花药中就有成千上万个小孢子，从花粉培养能得到更多的花粉植株。 七叶树花粉粒 1）自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在固体或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。 2）机械游离 挤压法 在烧杯或研钵中用玻棒等挤压花药， 将花粉挤出后收集培养。 磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液 中的花药， 使花粉游离出来； 9.2.2.1 花粉的分离与纯化  超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。 4）甘露醇处理法（0.3 mol/L甘露醇中25℃暗培养3～4 d ） 5）小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子。 梯度离心前 （小孢子形态、活力不一致） 30%蔗糖梯度离心后 （获得均一的小孢子群体） 9.3.2.2 花粉培养方式  平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。 液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。 双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。 预培养法 将花药在培养基上先培养3～4 d，再将花粉分离出来小三角瓶中作薄层培养。 微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养 条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。 看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。 看护培养图解 9.4 花药培养一步成苗 通常花药培养一般是采用脱分化、再分化和生根壮苗等几个培养程序，称为多级成苗。 一次成苗又称一步成苗或直接成苗，是指离体培养的花药组织的花粉细胞在一种培养基上同时完成脱分化和再分化过程，直接分化出完整植株的培养方法。 与多级成苗相比，一步成苗有以下几个优点： 1） 一步成苗简化了培养程序，降低了培养成本，加快了成苗速度。 2）一步成苗提高了花药培养效率。（提高绿苗率，主要通过胚状体成苗） 3）一步成苗中绿