電気泳動の基本その1.pptVIP

後編：SDS　SDS：SDS-polyacrylamido gel electrophoresis　　　　　　SDS-ポリアクリルアミド電気泳動 ゲル濃度と分子量 SDSにおいてSDS-タンパク質複合体が分子量によって分離される理由 * 8.8 5.3 7.1 3.7 3.9 8.8 7.1 7.1 5.3 3.9 3.7 8.4 8.4 8.8 7.1 8.8 7.1 7.1 5.3 5.3 3.7 3.7 3.9 3.9 8.4 8.8 7.1 8.8 7.1 7.1 5.3 5.3 3.7 3.9 3.9 3.7 電気泳動前 等電点電気泳動 SDS分子量 大 小 還元剤を用いてジスルフィド結合（S-S結合）を切断したタンパク質にSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を加えるとSDS-タンパク質複合体が生成される。これをポリアクリルアミドの分子ふるい効果を用いて分子量に応じて分離する。 native＝還元剤やSDSを用いずに行うPAGE 　　　　　　　　　? 分子量に応じた分離はできない 　　　　　　　　　? 泳動後に酵素活性やリガンドとの結合活性を調べることができる SDS DTT アクリルアミド N,N`ビスアクリルアミド ポリアクリルアミドゲル ＋ 重合 TEMED APS ポリアクリルアミドゲルの架橋構造 ～ ～ アクリルアミドとN,N`ビスアクリルアミド（Bis）の質量の合計％濃度＝％T アクリルアミドとBisの総和に対するBisの割合＝％C （％Cが一定の場合） ％Tが高くなるほど低分子の分離が良くなり ％Tが低くなるほど高分子の分離が良くなる 相対移動度（％） 分子量 ゲル濃度 0 50 100 105 104 10% 20% 15% ゲル濃度（％T）と分離能 5％??? 15％??? 4～15％??? 250 ※図中の数値の単位はkDa 160 100 75 250 60 100 37 25 20 10 15 250 50 100 37 25 20 10 15 75 150 ?電荷が大きい ?網の目を通りやすい形 ?分子量が小さい 分子の移動度が大きい タンパク分子の電荷と形を一定にすれば分子量に応じた分離ができる 網の目状の支持体 （ポリアクリルアミド） 分子ふるい効果とは??? SDSの構造 ー ＋ 疎水基 親水基 　　　SDS（ドデシル硫酸ナトリウム：sodium dodecyl sulfate） 　　　　＝陰イオン系界面活性剤 　　　　　 　　　　　　　?タンパク質と結合し負の電荷を与える 　　　　　　　?タンパク質の可溶化を促進する ①タンパク質はジスルフィド結合で強固な立体構造をもっている ②DTTなどの還元剤の働きでジスルフィド結合が切断される ③タンパク質の疎水性部分にSDSの疎水基が結合し、鎖状のSDS- 　 タンパク質複合体を形成する タンパク質立体構造の変化 S-S結合 還元処理 （　　　　） DTT SDS処理 （　　　　） SDS １ ２ ３ ー ー ー ー ー ー ー ー ー ー ー ー ー ー タンパク質本来の電荷にかかわらず大きな負の電荷をもつ タンパク質の総電荷は分子量5万の場合＋50～－50（pH8のとき） ドデシル硫酸基は－1の電荷をもっているので－300の電荷が与えられる SDS-タンパク質複合体の電荷は－250～－350となる SDSと結合したタンパクは??? ?分子の形は一定（直鎖状） ?ほぼ同程度の分子量／電荷比をもつ 移動度は分子量にのみ 依存する タンパク質1gに対しSDS約1.4gが結合 ?分子量5万のタンパク質では1分子あたりSDS約300分子に相当 SDSの模式図 Laemmli法の溶液系 上部泳動用緩衝液： 　Tris-Glycine-SDS(pH8.3） 濃縮ゲル： 　Tris-HCl（pH6.8）,SDS 分離ゲル： 　Tris-HCl（pH8.8）,SDS 下部泳動用緩衝液： 　Tris-Glycine-SDS(pH8.3） ー ＋ ウェル 　　塩素イオン SDS タンパク質 　　グリシン　 BPB + ー 濃縮ゲル中の陰イオンの配置 濃縮ゲルおよび分離ゲル中での陰イオンの動き 濃縮ゲル中の移動速度：塩素イオン＞タンパク質＞グリシン ?それぞれのゾーンの境界で一時的に電圧が大きくなるためタンパク質は濃縮される 　　塩素イオン SDS グリシン　 BPB + ー 分離ゲル中の陰イオンの配置 タンパク質 分離ゲル中の移動速度：塩素イオン＞グリシン＞タンパク質 ?グリシンがタンパク質を追い越すとタンパク質は分子量の違いで分離される 濃縮される 分離される pHレンジ　3-10 4-7