猪伪狂犬病毒通用型PCR检测试剂盒.doc

猪伪狂犬病毒通用型PCR检测试剂盒 【产品名称】 通用名称：猪伪狂犬病毒通用型PCR检测试剂盒 英文名称：Diagnostic Kit for Suid herpesvirus of PCR 【预期用途】 本试剂盒用于定性检测猪组织、分泌液中的猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）。猪是伪狂犬病病毒的天然宿主和贮存者，仔猪和其它易感动物一旦感染本病，死亡率常高达 100%，成年母猪和公猪多表现为繁殖障碍。本试剂盒适用于对猪伪狂犬病毒的辅助诊断。 【检验原理】 本试剂盒利用PCR技术，以猪伪狂犬病病毒基因组的高度保守序列为靶区域，设计特异性引物，通过PCR扩增实现对猪伪狂犬病毒核酸的快速检测。 【试剂盒主要组成成分】 名称 贮存温度 平衡液BL 室温（A盒） 缓冲液DG 缓冲液DD 缓冲液DW 使用前加入无水乙醇 DNA洗脱液 50倍TAE电泳缓冲液（50倍稀释后使用） 吸附柱和收集管 离心管 0.2mL薄壁离心管 扩增反应液 -20℃（B盒） 酶系 阴性对照 阳性对照 【适用仪器】 检测过程需要PCR仪、电泳系统、紫外成像系统等设备。 【检验方法】 一、样品制备 1. 样品采集：病死或扑杀的猪，取喉气管、胸肌、肺和脑等组织；待检活猪，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物， 置于 50%甘油生理盐水中。2~8℃保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。） 2. 样品处理：每份样品分别处理 2.1 组织样品处理：每份组织随机从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05g于研磨器中研磨，后转移至1.5mL灭菌离心管中。 2.2 全血样品处理：待血凝后取血清200μL，置1.5mL灭菌离心管中。 2.3 液体样品处理：取上清200μL，置1.5mL灭菌离心管中。 二、操作步骤 1 核酸提取（A盒） 1.1 吸附柱活化：向吸附柱中加入600μL 平衡液BL，室温静置5min，12000rpm离心30-60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； 1.2 取已处理的样品，分别加入600μL缓冲液DG，温和的上下颠倒混匀6~8次，室温静置5min； 5000rpm离心1~2min，将上清全部转入吸附柱，静置1~2min； 1.3 室温12000rpm离心30~60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管。 1.4 向吸附柱中加入600 μL缓冲液DD，12000rpm离心30-60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管。 1.5 向吸附柱中加入800 μL 缓冲液DW，12000rpm离心30-60s，弃掉收集管中的废液。 1.6 将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm离心2min，将吸附柱中残余的液体去除。 1.7 将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60μL的DNA洗脱缓，室温放置2min。 1.8 室温12000rpm离心1min，离心管中液体即为模板DNA，-20℃保存或直接进行下游实验。 2. PCR扩增（B盒） 2.1 配液（在试剂准备区进行）：取出扩增反应液，室温融化后充分混匀，短暂离心，并按反应个数分别取反应液和酶按照以下配比配制反应液：（注意应考虑有阳性对照和阴性对照甚至空白对照） 试剂 扩增反应液 酶系 用量（反应个数为ｎ） 17μL×ｎ 0.8μL×ｎ 反应液配制时应充分混匀，短暂离心，按17.5μL/管分装到PCR反应管中，转移至样本处理区。 2.2 加样（在样本处理区进行）：分别加入2.5μL步骤二中处理好的样本、阴性对照、阳性对照，盖好管盖，转移至核酸扩增区。 2.3 PCR扩增检测（在核酸扩增区进行）： 将反应管置于PCR仪样品槽中，设置扩增反应条件为： 48℃ 10min，94℃ 2min； 94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，35个循环； 72℃ 5min。 3.电泳（在产物分析区进行） 利用1×TAE电泳缓冲液制备1.5%的琼脂糖凝胶，取RT-PCR扩增产物点样5μL进行电泳，同时以DNA分子量标准品为参照，电压5V/cm，电泳25~30min，即可断电取凝胶于紫外成像系统中拍照或直接于紫外灯下观察电泳结果。 【有效期】 本产品有效期为6个月。 洛阳莱普生信息科技有限公司 洛阳莱普生信息科技有限公司 地址：中国·洛阳 洛阳市洛龙科技园区牡丹大道西N3号 邮编：471000 电话：座机电话号码 传真：座机电话号码