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大鼠皮质受损区域Cdk5与细胞凋亡的相关性研究 　　【摘要】 目的：研究皮质受损区域细胞周期素依赖蛋白激酶5（Cyclin-dependent kinase 5，Cdk5）与细胞凋亡的关系。方法：采用Feeney’s自由落体模型制作大鼠颅脑损伤模型，随机分为2 h、1 d、3 d及7 d组，用免疫组化的方法检测创伤性脑损伤后受损脑皮质区域中Cdk5的表达情况；TUNEL方法检测该区域神经细胞的凋亡情况；WesternBlotting方法检测蛋白Cdk5时序表达水平变化的情况。结果：大鼠受损皮质区域Cdk5表达随时间增加而增加，7 d达到高峰；受损皮质区域凋亡阳性细胞变化趋势与Cdk5基本一致；细胞凋亡系数与Cdk5呈正相关性（r=0.88，P0.05）。对照组无明显变化。结论：大鼠皮质区域损伤可诱导Cdk5数量及激酶活性增加，从而参与神经细胞凋亡。 　　【关键词】 颅脑损伤； 细胞周期素依赖蛋白激酶5； 细胞凋亡 　　doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.08.006 　　Cdk5为丝/苏氨酸胞周期素依赖蛋白激酶（Cyclin-dependent kinase，Cdk）家族一类成员，存在于神经系统中，含292个氨基酸残基，相对分子质量为33×103，激活后可磷酸化不同的相关底物。到目前为止鉴定出的Cdk5底物约有20余种，包括蛋白激酶K、Tau蛋白、神经丝蛋白及β-连环蛋白等[1-5]。近年来，在脑缺血再灌注损伤研究中发现Cdk5是神经细胞凋亡过程中重要的上游因子[6-7]。然而，到目前为止关于Cdk5与细胞凋亡的相关性在大鼠损伤模型中国内外鲜有报道，因此阐明颅脑损伤后Cdk5与细胞凋亡的相关性，对临床寻找新的治疗靶点有重要意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂 免疫组化染色试剂盒：北京中杉金桥生物公司。Anti -Cdk5：货号bs-1090R，北京博奥森。DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物公司。PVDF膜（0.22um）品牌pall：广州誉维生物科技仪器有限公司。TUNEL凋亡检测试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。 　　1.2 实验动物及分组 将大鼠48只（雄性，体重180～220 g，来源于南方医科大学实验动物中心）随机分为两组，即造模组（颅脑损伤组）和对照组（空白组）各24只，各组再随机均分为4个小组（n=6）；各小组时间点确定在损伤后2 h、1 d、3 d及7 d（以缝合头皮结束开始计时为0时）。实验过程中不符合实验要求的大鼠予以相应替换。 　　1.3 大鼠颅脑损伤模型的制作方法 造模组采用Feeney’s自由落体模型制作大鼠颅脑损伤模型（Trauma Brain injure，TBI）。大鼠麻醉成功后固定，在无菌条件下操作，选取左顶部前囟点和人字点中间偏离正中线约3.5 mm处纵形切开头皮，持牙科钻去除骨瓣，大小约0.6 cm×0.6 cm，注意勿损伤硬脑膜。安装自由落体撞击装置，撞击点设为左侧顶叶皮层，祛码重量为20 g，撞击高度为30 cm，撞击力为600 g?cm，制造中度颅脑损伤模型。撞击后行伤口及板障止血后缝合头皮。对照组仅切开头皮打开骨窗并行伤口板障止血后即缝合头皮。大鼠处死前行大鼠神经运动功能评分。 　　1.4 标本的处理及切片的制备 用3%戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后打开胸腔，用PBS缓冲液经左心室灌注，打开右心耳至留出清亮液体，再用4%多聚甲醛PBS缓冲液10～15 d/min灌注，处死动物并固定60 min后断头。在冰盒上快速开颅取脑，切取左侧损伤侧大脑，再以损伤灶为中心冠状面水平切取左侧大脑为前后两半，一半行切片免疫组化检查，另一半行Western Blotting蛋白检测。行切片免疫组化检查的受损区域脑组织用石蜡包埋，然后以冠状位由损伤皮质区中心向后连续切片，切片厚约5 μm。另外一半行Western Blotting蛋白检测的脑组织行受损区域脑皮质分离，在冰盒上操作，剥离硬脑膜，用小镊子从切面处将脑皮质向外侧分离，完整分离出脑皮质，放入冻存管，做好标记，保存于-80 ℃液氮瓶里。 　　1.5 免疫组织化学染色 石蜡切片行免疫组化染色，方法为兔超敏二步法，切片用3%的H2O2封闭10 min后，用pH=6.0的枸橘酸溶液加热孵育15 min行抗原修复。冷却至室温后用5%山羊清室温封闭20 min。滴加Cdk5一抗4 ℃过夜。PBS清洗后依次滴加试剂1和试剂2室温孵育20 min。DAB显色剂显色，冲洗，苏木素复染，常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。Cdk5的表达均以细胞浆和胞膜内侧出现黄色或棕黄色着色为阳性。 　　1.6 Western Blotting蛋白检测 蛋白提取试剂盒提取冰冻脑皮质组织（约