大肠杆菌抗氧化系统一oxyR调节子对细菌生长繁殖的调控作用.docVIP

大肠杆菌抗氧化系统一oxyR调节子对细菌生长繁殖的调控作用 　　摘要：OxyR调节子是最早发现的细菌抗氧化防御系统之一，大肠杆菌oxyR调节子中参与抗氧化作用的基因成员包括katG、ahpC、ahpF等，通过对H2O2及过氧化物等的直接清除方式发挥作用。虽然该方面的研究很多，但对于大肠杆菌oxyR调节子对细菌生长繁殖的影响尚不清楚。通过对大肠杆菌oxyR、ahpCF、katE/G基因突变菌株进行研究，突变体JI370中ahpCF基因缺失导致其内源H2O2积累减少使其生长相应加快，而对于katG和katE基因突变体JI367和ahpCF、oxyR基因突变体LC74来说，胞内H2O2极显著上升会抑制细菌生长，并且H2O2积累量越大对其生长抑制作用越明显。与野生型菌株相比，ahpCF的缺失突变菌株JI370和ahpCF及oxyR双突变的LC74在菌株生长的潜伏期受到更显著的影响。结果表明：在CAT（catalase，CAT）与AHP（alkylhydroperoxide reductase，AHP）协同清除内源H2O2的作用中，AHP起到主导作用，并且在细菌的生长繁殖中，ahp基因起到重要的作用。 　　关键词：过氧化氢酶；过氧化氢；大肠杆菌；生长繁殖 　　中图分类号：Q935 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847（2014）04-0323-04 　　活性氧是生物体有氧代谢产生的一类具有较强氧化能力的含氧化合物，包括超氧阴离子、羟自由基等自由基物质和过氧化氢（H2O2）、单线态氧等非自由基物质。H2O2作为生物体信号的同时也会对生物体造成严重的伤害，因此生物体拮抗H2O2的机制研究一直是生物学研究的重点之―。 　　病原细菌对H2O2的降解（即抗氧化）是侵染中的重要毒性机制之一。经报道细菌抗氧化系统是细菌抵抗呼吸作用及环境因素导致的氧化损伤的一套防卫系统，oxyR调节子则是最早发现的具有抗氧化作用的系统之一。它是LysR家族的部分蛋白的转录激活子，存在氧化型和还原型两种状态，通过两种状态之间的转化，识别H2O2，能够调控过氧化氢酶（catalase，CAT）和烷基过氧化物还原酶（alkyl hydroperoxide reductase，AHP）的表达。大肠杆菌能产生两种过氧化氢酶（CAT）：HP I （katG基因产物）和HPⅡ（katE基因产物），两者在结构、动力学特性和调控机制方面存在显著差异。但任何一种基因的缺失都会导致自然突变率的增加和H2O2敏感性的上升，CAT主要是清除菌体内高浓度的H2O2。烷基过氧化物还原酶（AHP）由22kD的C催化亚基和56kD的F还原亚基组成，能够以NADPH或NADH作为协同因子参与被氧化的ahpC的再生，是大肠杆菌内源过氧化氢的最初清除剂，能够清除菌体内低浓度的H2O2，它能与具有高Km的CAT协同调控胞内H2O2浓度。 　　细菌中oxyR及其介导的抗氧化体系研究有一定进展。本实验室前期工作中发现细菌内源H2O2与细菌的繁殖密切相关，但是，oxyR介导的抗氧化体系在细菌生长繁殖中的作用还未见报道。作者以oxyR、ahp、kat基因突变株为研究对象，尝试探讨oxyR基因簇中各基因在细菌生长繁殖中的协同作用，为细菌抗氧化调控机制的研究提供科学证据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　大肠杆菌野生型菌株MG1655、ahp基因C和F亚基的双突变菌株JI370（（ahpC-ahpF） del kan：：ahpF）、ahp基因C和F亚基以及oxyR基因共同缺失的突变菌株LC74 （delOxyR：spec （ahpC-ahpF）del kan：：ahpF），均由美国伊利诺斯州立大学的Imlay教授惠赠。将冻干保存的上述菌株取干粉划线接种到LB平板上，37℃下培养16h以上，挑单菌落至LB液体培养基中，37℃培养至菌液浑浊，甘油保存菌种，备用。 　　1.2主要试剂 　　荧光染料AR（amplex Red），辣根过氧化物酶（HRP）购自美国Sigma公司。过氧化氢酶（CAT）、过氧化氢、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾购自上海生工公司，所用化学试剂均为分析纯。 　　1.3荧光法检测内源H2O2 　　培养大肠杆菌野生型和突变体菌株至对数期，离心收集菌体，用无菌水重悬15min，备用。1mg AR溶解于0.75mL DMSO中，避光保存。用50mmol/L磷酸钾缓冲液（pH=7.8）溶解HRP形成终浓度为0.02g/L酶液。测定H2O2时，用0.45mL的待测样品液与0.25mL AR和0.25mL HRP混合，采用F-4500荧光分光光度计检测其荧光强度，并用标准液做出标准曲线转换为H2O2浓度。采用激发波长525nm，发射波长550～650nm。 　　1.4