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定量研究石斛醇提取物对酵母朊病毒的治愈作用 　　摘要：为研究石斛醇提取物的抗朊病毒作用，借助酵母朊病毒[PSI+]表型系统分析石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]表型的作用，引入半变性琼脂糖凝胶电泳技术在蛋白质水平分析石斛醇提取物对酵母朊病毒的治疗效果结果显示，石斛醇提取物浓度在15g/L时，作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5d的治愈率为5%；并且石斛醇提取物浓度在5～20g/L范围内时，药物剂量与酵母朊病毒[PSI+]表型治疗效果呈现较好正相关性。蛋白水平试验表明石斛醇提取物作用酵母朊病毒[PSI+]细胞5d后红色菌落的朊病毒聚集体大小与[psi-]相似。 　　关键词：石斛醇提取物；酵母朊病毒；[PSI+]；治愈 　　中图分类号：S859.3 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847（2014）04-0344-05 　　朊病毒是一类能在人和哺乳动物中引起可传染性海绵状组织脑病（transmissible spongiformencephalopathies，TSEs）的病原体，由于其致病机理的复杂性，迄今为止对于朊病毒疾病仍缺乏有效的治疗药物。我国的中医、中药学对于阿尔茨海默症和帕金森病等与朊病毒疾病发病机理相似的疾病的治疗有悠久的历史，而且有研究显示在绿茶和姜黄提取物中存在具有抗朊病毒活性的成分，暗示着中药在筛选抗朊病毒药物中的巨大潜力。 　　近年来，抗朊病毒药物筛选模型是国际上筛选抗朊病毒候选药物的热点；由于动物朊病毒细胞模型不具备明显的细胞表型；并且存在着与哺乳类动物内朊病毒交叉传染的危险性，使得实验成本昂贵、操作繁杂，严重限制了该领域的研究进展；而酵母朊病毒[PSI+]具有易于检测的遗传表型及其与动物具有严格种间屏障的优势，因此基于酵母细胞的抗朊病毒候选药物筛选模型在大规模筛选上具有经济、安全和易实现高通量筛选等特性，而越来越受到关注；而且利用酵母模型Bach等从近4000种小分子化合物中筛选发现了11种可以治愈酵母朊病毒细胞的化合物，并且证实KP16-氨基菲啶和胍那苄等3种化合物能够在动物细胞模型中清除聚集状态的哺乳动物朊病毒。本研究借助酵母朊病毒[PSI+]模型并结合表型实验和半变性琼脂糖凝胶电泳技术（semi-denaturing detergent-agarose gel electroph-oresis，SDD-AGE），研究石斛醇提物对酵母朊病毒[PSI+]的治愈作用。 　　l材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1菌种 　　酿酒酵母（Saccharomyce.s cerevisiae）： MA Takar1 SUQ5 ade2-1 his3△202leu2△l trp1△63 ura3-52 erg6：：KanMX，[PSI+]。 　　1.1.2培养基 　　1/2YPD液体培养基：0.5%酵母浸出粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖，葡萄糖单独灭菌。 　　1/2YPD固体培养基：0.5%酵母浸出粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂粉，pH天然，葡萄糖单独灭菌。 　　YPAD固体培养基：1%酵母浸出粉、2%蛋白胨、0.04%腺嘌呤、2%葡萄糖、2%琼脂粉，葡萄糖单独灭菌。 　　SD-Ade固体培养基：0.7% YNB-AA、2%葡萄糖、2%琼脂粉，pH天然，葡萄糖单独灭菌。倒平板前加入氨基酸His、Ura、Trp、Leu分别为20、20、20、60mg/L。 　　1.1.3主要试剂和仪器 　　石斛购于辽宁省沈阳市国大药房；腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸等购于北京市鼎国技术有限公司：羊抗Sup35抗体与HRP标记的驴抗羊IgG购于圣克鲁斯生物技术公司（美国）；琼脂糖水平电泳槽（DYC0-31DN，北京六一公司）；转膜仪（Bio-Rad公司，美国）；珠磨破碎仪（Bio spec公司，美国）；旋转蒸发器（RE52CS-2，上海亚荣生化仪器厂）。 　　1.2方法 　　1.2.1石斛醇提取物的制备 　　称石斛粉末10g，加入8倍体积的80%乙醇回流提取3次，每次3h，合并3次的提取液，60℃减压蒸发，浓缩至50mL，然后烘干至恒重，用5% DMSO（二甲基亚枫）溶解成200g/L的提取液备用。 　　1.2.2石斛醇提取物对酵母朊病毒[PSI+]治愈作用的研究 　　[PSI+]酵母细胞在24℃过夜活化培养后，调整菌液光密度OD600为0.2左右，按10%接种量分别接种到含有不同浓度石斛醇提取物的1/2 YPD液体培养基中，所有体系于24℃振荡培养5d，每隔24h更换培养基和石斛醇提取物；分别在1、3、5d取培养液稀释后涂布于1/2 YPD固体平板，平板于24℃恒温培养7d，观察菌落颜色变化，统计阳性菌落的比例[15]。 　　1.2.3石斛水提取物的制备及对酵母朊病毒[