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丹参多倍体育种技术研究 　　【摘 要】目的：在组织培养条件下诱导丹参多倍体，来考察不同浓度、处理时间和处理方法不同时对诱导率产生的影响。方法：以不同剂量的秋水仙素为诱导剂，将幼苗、叶片、和愈伤组织三个外植体通过三种不同的实验方法，来研究不同时间内对丹参诱导率产生的影响。结果：幼苗处理法中，40 mg/L秋水仙素处理5 d的效果最明显，幼苗加倍率12%；叶片处理法时，15 mg/L处理1周的效果最好，加倍率最高达34.13%；愈伤组织处理时，5 mg/L处理1周的效果最好，加倍率最高达33.23%。结论：因此要得到较高的加倍率和成活率，选择适宜的外植体、处理时间和秋水仙素含量是非常重要的。实验证明离体培养的早期诱导比成苗后诱导效果好。 　　【关键词】丹参；组织培养；多倍体育种；植株再生 　　丹参是唇形科鼠尾草属植物，因其种子发芽率低，所以一般不采用种子繁殖[1]。发育不良、种子发芽率低和品质退化是导致丹参成活率和产量较低的主要原因。近年来，随着丹参越来越多的被人们应用于临床试验，大量的丹参遭到人们的挖采，丹参资源日益减少，有些稀有品种已濒临灭绝。丹参具有丰富的药理作用。能有效的治疗冠心病；抑制体外肿瘤细胞的增殖[2]；具有抗菌消炎的作用[3]；是医治心脑血管系统疾病不可或缺的药物。 　　多倍体药用植物一般具有根、茎、叶和花果的巨型性，抗逆性强，药用成分含量高等特性，这正是药材优质、高产育种所期望达到的目标[4]。多倍体诱导的方法有很多。取得了不错应用效果。石荫坪[5]利用枣子的胚乳，培养出了三倍体苗木。胚乳培养缺点就是愈伤组织继代培养时会出现变异的染色体，最后会出现杂合体、嵌合体、二倍体的再生植株。陈柏君[6]等诱导黄芩同源四倍体时采用组织培养的方法先获得愈伤组织，然后转移到分化培养基上诱导生芽，当培养基上长出绿色芽点时，将带芽点的愈伤组织置于含有秋水仙素的培养基上培养，或放入秋水仙素水溶液中浸泡，最后依次经分化及生根培养基培养获得再生植株。陈素萍.等也利用组织培养技术成功诱导了党参多倍体，获得了大批量的再生植株。 　　1 实验材料、试剂和仪器 　　1.1 实验材料 　　丹参的幼苗；叶片；愈伤组织 　　1.2 实验试剂 　　1）娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司生产；批号：220930 规格：1.25L/瓶； 　　2）秋水仙素，上海谷研科技有限公司生产；CAS号：64-86-8 规格：25g/瓶； 　　3）卡诺固定液，上海君瑞生物科技有限公司；货号：JR00936 规格：100M； 　　4）混和酸（45%醋酸，1mol盐酸，l%硫酸铵100，10：1混和）； 　　5）70%和95%的酒精； 　　6）75%的乙醇。 　　1.3 实验仪器 　　普通光学显微镜 拓丰仪器科技（上海）有限公司 　　2 实验方法 　　2.1 培养基配制 　　2.1.1 培养基和培养条件 　　分化培养基： 2 mg?L-1细胞分裂素（6-BA）+MS+7g?L-1琼脂+0.2 mg?L-1生长素（IAA）+3%蔗糖；诱导愈伤培养基：2mg?L-1细胞分裂素（6-BA）+MS+0.2mg?L-1生长素2，4-D+7 g?L-1琼脂+3%蔗糖；生根培养基：0.2 mg?L-1生根粉ABT+1/2MS+7g?L-1琼脂+2%蔗糖。培养条件是在25℃左右。 　　2.2 秋水仙素配制方法 　　将秋水仙素直接放在冷水中进行溶解，或者先把它放在少量的酒精中进行溶解，然后加入冷水。配制好的溶液应放在棕色玻璃瓶中进行贮存，并且把瓶子放在暗处，避免阳光直射，此外瓶盖应拧紧，以减少与空气的接触，防止药效挥发。 　　2.3 检测方法 　　丹参的多倍体形成完整植株后，切去0.5 cm的根尖，采用文献[9]的方法对根尖进行染色体鉴定。起初将切好的根尖用蒸馏水清洗3次，放进0.1%秋水仙碱溶液中处理1.5 h，取出后用蒸馏水再洗3次，放进卡诺固定液中固定2 h，然后分别用95%与70%乙醇、蒸馏水各洗3次，再用混和酸（45%醋酸、1mol/L盐酸、l%硫酸按100：10：1混和）在室温下离析80min，最后水洗3次，放入70%乙醇中保存，最后进行镜检。 　　2.4 多倍体诱导 　　开始诱导丹参多倍体，通过三种方法从秋水仙素剂量、处理方法和处理时间三个方面来对比研究观察。 　　2.4.1 幼苗处理法 　　将浓度为30，40，50mg/L的秋水仙素过滤灭菌后加入分化培养基，将长1.5～2cm丹参幼苗转入该培养基中，分别料理5，7，10d，各3次重复，每组处理50株。移到生根培养基之后，开始1周转继1次，转2次后间隔的时间可加长。 　　2.4.2 叶片处理法 　　参照文献[10]等的培养方法，将带柄的丹参幼叶切成0.2cm2