人类白细胞抗原基因HLA―B58∶01基因型的快速低成本鉴别方法.docVIP

人类白细胞抗原基因HLA―B58∶01基因型的快速低成本鉴别方法 　　摘要：采用焦磷酸测序技术和改进的全血基因组提取方法，建立了位于6号染色体的银屑病易感基因1候选基因1（Psoriasis susceptibility 1 candidate 1，PSORS1C1）rs9263726位点的焦磷酸测序方法，检出限达到0.4 ng/μL基因组DNA，20例标本的焦磷酸法和Sanger法测序结果完全一致。利用本方法对683例标本的rs9263726位点进行测序，得到中国人群该位点野生型（GG型）分布频率为87.6%，突变的GA型分布频率为11.7%、AA型分布频率为0.7%。通过对随机选取的46例标本rs9263726位点与人类白细胞抗原基因HLAB*58∶01基因型的连锁关系进行分析，结果表明，该位点预测HLAB*58∶01基因型的灵敏度为100%、特异性为91.3%。本方法可用于HLAB*58∶01基因型的检测。 　　关键词 ：人类白细胞抗原基因HLAB*58∶01； 焦磷酸测序； rs9263726位点； 基因型 　　1 引 言 　　别嘌呤醇被广泛应用于临床高尿酸血症的常规治疗，但是其皮肤型不良反应在用药前无法预知，特别需要注意的是，发生不良反应的人群中约有1%～5%为StevensJohnson综合征（SJS，皮肤脱落小于体表面积的10%，死亡率为1%～5%），20%～30%为中毒性表皮坏死松解征（TEN，皮肤脱落大于体表面积30%， 死亡率25%～35%）[1，2]，急剧增加了患者的死亡风险。2005年， Hung等[3]发现，由于别嘌呤醇引发SJS/TEN的51位中国汉族人，全部含有人白细胞抗原基因HLAB*58∶01；2009年，Tassaneeyakul等对泰国人别嘌呤醇致敏的分析发现，HLAB*58∶01等位基因预测别嘌呤醇诱发的SJS/TEN过敏的灵敏度（含有HLAB*58∶01等位基因的标本正确判定此标本会发生别嘌呤醇诱发的SJS/TEN过敏反应的比例）为100%，特异性（不含有HLAB*58∶01等位基因的标本正确判定此标本不会发生别嘌呤醇诱发的SJS/TEN过敏反应的比例）为87%[4]。据最新dbMHC等位基因频率数据库统计，HLAB*58∶01等位基因的携带频率欧洲为0.77%，北美洲为0.38%，大洋洲为2.5%，东北亚为6.1%，在世界不同地区人群中的携带频率有显著的差异。2010年国际组织相容性工作组报道华人携带率平均为8.8%～10.9%，远高于东北亚分布水平，因此中国汉族人群属于别嘌呤醇引发SJS/TEN的高风险群体。 　　HLA目前的分型方法主要有3类：血清学、细胞学和分子生物学分型法。其中血清学和细胞学分型法，由于高特异性的抗体和特异的细胞获取困难，且操作繁琐，因此目前很少使用。分子生物学分型方法主要有聚合酶链反应等位基因组特异性引物（PCRSSP）[5]、多聚酶链反应序列特异寡核苷酸探针（PCRSSOP）[6]、聚合酶反应直接测序法（PCRSBT）[7]。前两种方法属于低分辨HLA分型方法，容易产生假阳性；PCRSBT可以直接对HLA基因型的序列进行测定，分辨率高，能直接发现新的等位基因，但是由于杂合子的存在，需将同源染色体分离后才能得到各个单元型的准确结果，增加了操作的复杂性，检测成本也相应增高[8]。 　　2013年，Tohkin等[9]对日本14个别嘌呤醇诱发的SJS/TEN过敏人和991个正常健康人的全基因组关联研究分析表明，位于6号染色体的银屑病易感基因1候选基因1（Psoriasis Susceptibility1 Candidate1，PSORS1C1）上的rs9263726位点，存在GA的多态性改变，该位点突变型A与HLAB*58∶01存在完全的等位基因关联。因此，如能证实中国汉族人群存在同样的等位基因关联，采用rs9263726位点代替HLA基因直接测序，进行别嘌呤醇用药前HLAB*58∶01高致敏基因型的筛查，可以有效降低SJS/TEN致死性皮肤性过敏发生的风险并节约成本。 　　焦磷酸测序技术具有操作简便、灵敏度高、无需荧光标记等技术优势[10～12]，本研究选用焦磷酸测序技术建立了rs9263726位点的多态性分析方法。随机选择了683例库存核酸标本，进行了rs9263726位点多态性分型，首次得到中国人群该位点的基因频率。同时，对46例标本进行了HLAB基因的PCRSBT直接测序和rs9263726位点多态性分析，对两种方法的结果进行了比较。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Q24焦磷酸测序仪（德国Qiagen公司）；A200基因扩增仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；微量紫外分光光度计（南京伍义科技有限公司）；VORTEX