高效液相色谱―质谱联用技术同时测定人体尿液中11种代谢物.docVIP

高效液相色谱―质谱联用技术同时测定人体尿液中11种代谢物 　　摘 要 采用高效液相色谱-质谱联用技术定量检测人体尿样中丙烯醛、苯、1，3-丁二烯、苯乙烯、巴豆醛的巯基尿酸类代谢物及氰化氢代谢物。将解冻后的尿样经高速离心后，取100 μL上清液，加入50 μL内标溶液及850 μL水后上样分析。色谱分析采用XSELECT HSS T3 C18色谱柱（150 mm×2.1 mm i.d，2.5 μm），以乙腈-15 mmol醋酸铵溶液梯度洗脱，流速250 μL/min，柱温40 ℃，在多反应监测模式（MRM）下采用负离子扫描模式进行定量分析。本方法共检测了16名吸烟者和6名非吸烟者的尿样，发现日吸烟量大于25支的吸烟者尿样中的烟气成分代谢物浓度高于非吸烟者。 　　关键词 高效液相色谱-质谱联用技术; 尿液; 代谢物 　　1 引 言 　　卷烟燃烧会产生大量的挥发性有机化合物（VOCs），其中就包括丙烯醛、苯、1，3-丁二烯、氰化氢、苯乙烯、巴豆醛等，这些挥发性有机物具有较强的致癌或致突变作用[1～3]，吸入后会对人体的代谢物产生影响。有些代谢物是吸入卷烟烟气后由烟气成分代谢产生的，称为外源性代谢物;有些则是人体本来就存在的代谢物，只是因为吸烟导致其含量变化，称为内源性代谢物。随着吸烟与健康这一话题的日渐升温，急需建立一种方便可靠的VOCs暴露量评价方法，直接针对代谢物进行分析。 　　目前， 通常采取检测呼出气体、血液及尿液中VOCs代谢物的含量评价VOCs的接触水平。其中检测尿样中VOCs的代谢物对人体的侵入性低，且取样方便，同时尿液中的代谢物相对于血液中母体化合物生物半衰期更长、更稳定，所以目前检测尿液中的代谢物逐渐代替了其它评价方法。已有一些文献报道测定这些有害气体在尿液中的代谢物，包括苯的代谢物苯巯基尿酸（S-PMA）、1，3-丁二烯的代谢物 N-乙酰基-S-（3，4-二羟基丁基）-L-半胱氨酸（DHBMA）等[4～8]，主要是针对一些特定的职业环境进行的研究，只能评价个别VOCs的影响，而对于烟气这种含有多种VOCs的复杂体系，同时测定多种VOCs代谢物的分析方法鲜有报道。本研究建立了同时测定11种代谢物的分析方法，评价烟气中氰化氢、苯乙烯、巴豆醛、苯、1，3-丁二烯对于人体的接触水平。本方法前处理简单，适合高通量分析，特别适合烟气中VOCs代谢物研究。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　1200液相色谱仪，配有G1329A自动进样器、G1311A四元混合泵以及G1316A柱温箱（美国安捷伦公司）;Eppendorf 5810R 高速离心机（德国Eppendorf公司）; API4000三重四级杆串联质谱仪，配电喷雾离子源（ESI）和Analyst1.6软件数据处理系统（美国应用生物系统公司）。乙腈、甲醇（质谱级，德国默克公司）;醋酸铵（色谱纯，德国默克公司）;代谢物标样及其内标（详见表1），其中MHBMA-1和MHBMA-2为1∶1混合物，实验结果以两种物质的总量计（纯度均99%，加拿大多伦多化学试剂公司）;Milli-Q Intergral纯水/超纯水一体化系统（德国Merck Millipore 公司）。 　　2.2 标样与尿样样品准备 　　用甲醇将各同位素内标配制成1 g/L的工作液。采用流动相将11种待测物的标准品配制成质量 　　2.3 液相色谱及质谱条件 　　液相色谱条件：色谱柱 XSELECT HSS T3 C18色谱柱（150 mm×2.1 mm i.d，2.5 μm，美国Waters公司）; 流动相： A为15 mmol/L醋酸铵溶液，B为乙腈; 流速： 0.25 mL/min; 梯度洗脱程序： 0～2 min， 97% A; 2～4 min，97%～5% A; 4～10 min， 5%～10% A; 10～10.5 min， 10%～50% A; 10.5～12.5 min， 50% A; 12.5～13 min， 50%～3% A; 13～20 min， 3% A。 　　质谱条件： 电喷雾离子源（ESI），负离子扫描方式，多反应检测（MRM）模式; 喷雾（IS）电压为： Symbolm@@ 4500 V; 雾化气（Gas1，氮气）： 为344.5 kPa; 气帘气（Curtain Gas，氮气）：压力为： 206.7 kPa; 辅助雾化气（Gas2，氮气）压力为310.0 kPa; 离子源温度（TEM）为： 600 ℃。 　　2.4 数据分析 　　为研究吸烟组与非吸烟组尿液代谢物之间的相关性，依据卷烟抽吸量不同，采用两样本双向t检验计算p值，来评估两组间的统计学差异。当plt;0.05时，认为统计学上有显著差异。 　　3 结果与讨论 　　3.1 分析