滇重楼鲨烯合酶基因PpSQS的克隆及在大肠杆菌中的表达.docVIP

滇重楼鲨烯合酶基因PpSQS的克隆及在大肠杆菌中的表达 　　[摘要] 目的：克隆滇重楼鲨烯合酶（squalene synthase，SQS）基因（PpSQS），对该基因进行序列分析及原核表达。方法：采用同源克隆和RACE技术获得PpSQS的cDNA，并对其进行生物信息学分析；构建原核表达载体pET-30b（+）-PpSQS，在大肠杆菌Escherich coli BL21（DE3）中进行诱导表达。结果：PpSQS基因cDNA全长1 498 bp，包含1个1 212 bp的开放阅读框（ORF），可编码403个氨基酸；PpSQS理论标准分子质量为46.36 kDa，等电点为pI 6.83；SDS分析表明，经1 mmol·L-1 IPTG诱导后，重组PpSQS蛋白在大肠杆菌中获得表达。结论：首次获得了滇重楼PpSQS基因cDNA全长序列，该基因编码产物具有植物SQS同源蛋白的典型特征，实现重组PpSQS在大肠杆菌中的表达。 　　[关键词] 滇重楼；鲨烯合；基因克隆；原核表达 　　传统药材重楼隶属于百合科重楼属，以蚤休之名首载于《神农本草经》，目前发现共有24种，分布在我国的重楼共有19种[1]。《本草纲目》记载重楼味苦、性微寒、有小毒、归肝经，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效。《中国药典》2010年版将滇重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch.） Hand. -Mazz收载为药用，以其干燥的根茎入药[2]。云南白药、宫血宁胶囊等药剂均以重楼为主要原料[3]。现代研究表明滇重楼含有抗癌成分，对心血管疾病也有特殊的疗效[4-5]。陈昌祥等研究表明重楼的主要活性成分是皂苷[6]，其苷元主要为异螺甾烷醇类（isospirastanols）的薯蓣皂苷（dioscin）和偏诺皂苷（pennogenin）。 　　植物甾醇皂苷由异戊二烯代谢途径合成（图1）[7]，该途径的第1个关键酶是鲨烯合酶（squalene synthase，SQS）[8]。 SQS催化两分子的法呢酯焦磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）缩合生成鲨烯（squalene，SQ），作为甾醇、三萜、胆固醇等萜烯类物质生物合成的共同前体[9]。此外，FPP还可作为其他酶的底物，生成赤霉素、类胡萝卜素等活性物质。因此处于分支位点的鲨烯合酶的表达水平和活性对于提高其下游产物，尤其是甾醇类皂苷的含量至关重要。 　　近年来，重楼的药用价值日益受到重视，重楼的使用日益增加，造成野生重楼资源破坏，其价格也不断攀升。但由于重楼种子具有“二次休眠”的生理特性[10]，且根茎的年生长量较低，种植周期长，难以实现其商业化种植和品质的提高。随着基因工程技术进行植物遗传性状改良的报道日益增多，该技术已成为解决重楼资源和产量问题的重要途径。目前，有关重楼甾醇类代谢途径工程研究尚属空白，其关键酶基因也尚无报道。本实验采用RT-PCR、同源克隆和RACE技术克隆滇重楼鲨烯合酶的基因序列，并成功构建了大肠杆菌表达载体，为进一步研究重楼皂苷合成机制和利用次生代谢工程手段提高其合成量奠定基础。同时通过鲨烯合酶基因这一功能基因的遗传学分析，从分子水平对重楼属植物种间及种内的亲缘关系进行鉴定，有利于促进重楼野生资源的保护。 　　1 材料 　　滇重楼种植于四川农业大学生物学实验基地，于2011年6月采样。大肠杆菌Escherichia coli菌株 DH5α和BL21（DE3）由本实验室保存。 　　植物RNAout（Trizol法）试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒及2×Taq PCR mix购自天泽基因工程有限公司；逆转录试剂盒Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 购自Fermentas公司；3′-Full RACE Core Set Ver.2.0，5′-Full RACE Kit，T4 DNA连接酶、pMD19-T Simple Vector，Taq DNA聚合酶购自Takara公司；pET-30b（+）购自Novagen公司；引物由英骏生物公司合成，其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。 　　2 方法 　　2.1 总RNA提取及cDNA第一条链的合成 采用植物RNAout试剂盒提取滇重楼新鲜叶片总RNA，并以其为模板使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，以Oligo-dT为引物制备cDNA第一链。 　　2.2 滇重楼鲨烯合酶基因cDNA的克隆 根据NCBI核酸数据库登录的SQS的cDNA序列，设计1对兼并引物。以cDNA为模板进行PCR，产物经连接转化后，挑选3个阳性克隆送英骏生物公司测序。参照3′-