病毒诱导的基因沉默技术方案.doc

病毒诱导的基因沉默 摘要:病毒诱导基因沉默（Virus induced gene silencing ,VIGS）是近年发现的一种转录后基因沉默的现象，是快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术，近年来成为植物基因功能研究的有力工具。文章从病毒诱导基因沉默的发现、类型、作用机制、优势及不足、影响条件及对发展前景的展望等方面进行了综述。 关键词病毒诱导的基因沉默；机制；应用；基因功能因功能 RNA介导的基因沉默(RNA- mediated gene silencing)是一种通过核酸序列特异性的相互作用来抑制基因表达的调控机制它广泛存在于各种生物中,在植物中称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing , PTGS)[1]病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing ,VIGS)属于转录后的基因沉默指携带植物功能基因cDNA 片段的重组病毒在侵染植物体后诱导植物发生基因沉默而出现表型突变可以通过植物表型或生理指标上的变化来反映该基因的功能.VIGS是20世纪90年代新兴的一种技术发展迅速已广泛应用于生物学诸多领域的研究 1 VIGS的建立与发展 VIGS一词最早出现于van Kammen[2]对病毒侵染后产生的回复现象的描述现已成为描述应用重组病毒抑制内源基因表达的专门词汇[3]最早的VIGS体系采用的病毒载体是典型的RNA病毒1995年Kumagai等人[4]在烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virusTMV)上插入了一段八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturasePDS) cDNA片段当TMV重组病毒侵染烟草后侵染植物的叶片变成白色研究表明被感染植株产生的白化效应是因为PDS mRNA水平显著降低引起的。PDS是类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶而类胡萝卜素在植物中具有光保护的作用类胡萝卜素合成途径被阻断导致植物光保护功能的丧失从而引起白化效应。1998年Baulcombe研究组[5]在马铃薯X病毒(Potato X virusPVX)基因组上同样插入了一段PDS cDNA重组病毒侵染植物后也出现了失去光保护作用的白化效应,由此他们提出VIGS可以有效地抑制植物内源基因的表达,从而可以利用病毒载体进行未知基因的功能鉴定2001年Baulcombe研究组[6]又报道了以烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virusTRV)为载体的VIGS体系发现无论在抑制转基因还是内源基因的表达上TRV载体诱导基因沉默的效率和持久性都优于PVX载体TRV本身产生的症状也轻于PVX目前TRV病毒载体已在番茄(Solanum lycopersicum)烟草(Nicotinaspp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、辣椒(Capsicum spp.)、拟南芥和棉花(Gossypium spp.)等多种植物上被广泛应用。1998年, Robertson研究组[6]利用双生病毒科的番茄金色花叶病毒(Tomato golden mosaic virus, TGMV)初步建立了以DNA病毒诱导的基因沉默来研究植物基因组功能的体系。利用TGMV的DNA-A为载体在本氏烟上先后成功诱导了镁离子螯合酶的关键基因Su(Sulfur)和转荧光蛋白基因(luc)发生沉默从而在叶片上出现黄色突变表型和转luc基因植株不再发出荧光。随后,非洲木薯花叶病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)和棉花皱缩病毒(Cotton leaf crumple virus, CLCrV )载体相继在木薯和棉花中得到成功应用, 这可能将极大地促进木薯和棉花的功能基因研究[7,8]。继RNA病毒和DNA病毒作为载体的VIGS体系之后Gossele等人[9]又发展了一种基于卫星病毒的VIGS体系, 他们对伴随TMVU2的卫星病毒(STMV)基因组进行了改造,使其具有插入外源片段的能力通过在烟草上对PDS等13个植物内源基因的测试结果表明STMV载体能够有效抑制这些基因的表达并呈现明显的表型突变由于卫星病毒的基因组具有在植物中复制水平高以及本身基因组小且在实验中容易操作等特点使其成为一种优良的候选沉默载体。 2 VIGS的作用机制 基因沉默在生物中普遍存在，其作用表现在抵御病毒、转座子等外来核酸的入侵，识别并抑制外源基因表达，维持生物基因组稳定性等（Baulcombe，2004）。VIGS作为基因沉默的特殊形式，是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒或携带cDNA的病毒载体侵染植物后，在复制与表达过程中通常会形成双链RNA（Double stranded RNA，dsRNA）形式的中间体。dsRNA作为基因沉默关键激发子，首先在细胞