培训课件-基因探针分子杂交技术.ppt

利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上 将x光片压于杂交后的DNA膜上，至于暗室进行充分曝光，然后将x光片通过显影液显色，便可得到如图的结果。若有带，说明存在与探针同源的DNA分子。 基因探针 ——分子杂交技术 By xxxxxx Molecular probe techniques 目录 简介 基本原理 分类 历史及发展 主要应用 基因探针 基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。 FISH 基因探针分析的基本原理 两条不同来源的核酸单链如果在一定区段具有互补的碱基序列,或者说具有一定的同源性,就可以特异性结合,形成双链杂种分子,这种结合称为核酸分子杂交。 如果用已知核酸(通常是DNA)片段作为探针,通过与未知核酸(DNA或RNA)样品进行杂交试验,根据两者杂交状况的分析,就可以确定它们同源性程度,检测特定核苷酸序列在样品中的存在及含量。这便是核酸探针分析的基本原理。 分子杂交技术的分类 根据其检测对象不同，可分为 检测对象 探针 Southern杂交 DNA 核酸 Northern杂交 RNA 核酸 Western杂交 蛋白质 抗体 根据探针来源的不同，可分为 来源 基因组探针 （genomic probe） 基因组 cDNA 探针 （cDNA probe） mRNA 寡核苷酸探针 （Oligonucleotides?Probe） 人工合成 基本操作程序 印迹（blotting） 将样品在凝胶上分离，然后将样品通过“影印”的方式转移到固相支持物上（如滤膜）。 杂交 将已印迹有样品的滤膜与带有放射性标记或其它标记的探针进行杂交。 结果检测 通过放射自显影或显色反应，判断样品中是否有与探针同源的分子。 Southern杂交 检测样品DNA的处理 电泳分离及变性处理 转移并固定到滤膜上 探针的制备及杂交 检测与分析 检测样品DNA的处理 提取检测样品的基因组DNA 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段 电泳分离及变性处理 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 变性处理 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱变性、化学试剂变性 在0.4M NaOH碱性条件下变性 凝胶 0.4M NaOH 转移并固定到滤膜上 通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射将DNA固定在滤膜上。 转移的方法 毛细管虹吸法、电转移法、真空转移法 探针的制备 一、探针的合成 PCR、化学合成等方法 二、探针的标记 同位素：3H、35S、32P等 非同位素：地高辛、生物素、荧光素等 地高辛： 可以与dCTP连接成地高辛-dCTP 原理： 地高辛 + 抗地高辛抗体 （带有荧光素或酶的标记） 杂交 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。 杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸在滤膜上。 ?洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。精确控制杂交及洗涤条件（如温度及盐浓度），在同源序列中即使有一对碱基错配也可检出。这技术已应用于遗传病（基因病）的临床诊断。 安装杂交管 杂交炉 检测与分析 1、放射自显影：适用于放射性同位素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非同位素标记的探针 通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分子量。 Northern杂交 1、检测对象为RNA。 2、与Southern杂交不同的是：1）不需要限制性核酸酶切；2）变性方法不是碱变性，而是采用化学试剂变性法。 3、主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，或比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。 Western杂交 1、基本原理和基本过程与Southern杂交基本相同 2、检测对象为蛋白质（或酶） 3、SDS电泳分离 4、用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。 历史及发展 1969年，Gall和Pardue（Yale University）等首次将同位素探针用于原位杂交实验，获得成功。1987年，染色体原位抑