培训课件-讲义基因诊断.ppt

㈠ras癌基因的检测 ras基因中最常见的点突变是第12，13或61密码子突变 检测方法： PCR/ASO PCR-SSCP ㈡ p53的检测 p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130~290，其中175、273、284密码子突变最常见。 检测方法： PCR—SSCP PCR—测序 PCR—RFLP Total RNA from HeLa or NCI-H23 cells were reverse-transcribed into cDNAs in the presence of Biotin-dUTP. The biotin-labeled cDNA probes were then hybridized individually to the Human TranSignal p53 Target Gene Array. p53 Target Gene Array 四、基因诊断在法医学上的应用 DNA指纹 人类个体的多样性和个性取决于基因组DNA核苷酸序列的差异，即DNA的多态性。其中，微卫星DNA和小卫星DNA等 是重要 的多态性标志。 DNA指纹 针对重复序列人工合成寡核苷酸短片段作为探针，与经过酶切的人基因组DNA进行Southren blot 杂交，可以得到大小不等的杂交带，而且杂交带的数目和分子量大小具有个体特异性，就像人的 指纹一样，因而把这种杂交带图谱称为DNA指纹或基因指纹。具以下特征： （1）一个DNA指纹探针可同时检测多个位点的变异，因而更能反映基因组的特异性 （2）具有高度的特异性，只有同卵双生的子女才有完全相同的 指纹 （3）具有稳定的遗传性 （4）DNA指纹图谱具有体细胞稳定性，即从同一个体中不同组织、血液、肌肉、毛发等产生的DNA指纹完全相同。 法医学上的应用 个人识别 亲子鉴定 性别鉴定 四、限制酶酶谱分析 基因突变导致酶切位点的丢失或相对位置发生改变 以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段，的长度，数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。 ㈤ DNA序列测定 是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法。不仅可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。 分子克隆到T载体上，或直接对扩增产物进行测序。 DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。 （六） DNA芯片技术 基因芯片(gene chip) 目 录 二、基因诊断的基本方法 基因变异致病的类型： 内源基因的变异 基因结构的突变 点突变、插入、缺失、重排、异位、 基因扩增， 基因表达异常 mRNA剪接异常 外源基因的插入 ㈠基因突变的诊断 点突变的诊断 ①诊断已知的点突变 （PCR/ASO） ASO allele specific oligonucleotide 等位基因特异性寡核苷酸探针 突变碱基置探针中央 控制杂交条件 结果分析： A T C G 探针定位 正常 C T (纯合子) C T C G C A (杂合子) （新突变） （新突变） ②诊断未知的突变 PCR/SSCP/测序 DNA芯片技术（大规模未知突变的筛查） N 4×n 1.28平方cm 16000个寡核苷酸 2 .大片段丢失或插入的诊断 外侧确定有无缺失及缺失片断的相对大小 内侧确定缺失部位. ㈡多态性连锁分析 DNA多态性——在同种生物不同个体的基因组中，常存在一些不影响基因功能的DNA顺序变异，称为DNA多态性（polymorphism） DNA多态性标记 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP) 短串联重复序列（short tandom repea