第五章 基因治疗_幻灯.pptVIP

（1） 研究基因功能的新工具? 由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。 ? RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。 （2） 肿瘤的基因治疗?? 传统反义RNA技术诱发的单一癌基因的阻断，不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长， 而RNA干扰技术可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的双链RNA分子，只使用一种双链RNA即可以产生多个基因同时剔除的表型， 也可以同时使用多种双链RNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。 RNA干扰技术可用于治疗有异常基因表达的恶性肿瘤。 K-ras蛋白为肿瘤发生所必需，bcr/ab1融合基因与人白血病有关， 用RNA干扰技术可以阻碍K-ras蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。 通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达，能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。 （3） 病毒性疾病的基因治疗? RNA干扰可以被看成是一种与免疫系统类似的防御机制。 用siRNA抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表达，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻碍HIV在细胞内复制。 用RNA干扰技术抑制HIV的受体（CD4）或辅助受体（CXCR4或CCR5）在细胞内表达，可阻碍HIV感染细胞。 也可通过RNA干扰抑制其他病毒在细胞内复制，如脊髓灰质炎病毒、人乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。 siRNA在病毒感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，RNA干扰技术将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意义。 （三）核酶(ribozyme)用于基因治疗 天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。 在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNA）的目的。 只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。 锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图 三个双螺旋区 13个核苷酸残基保守序列 剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生 （N代表任意核苷酸，H代表A,U或C） 1. 核酶的设计 核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。 （1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。 （2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。 在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。 核酶的作用机制 2.核酶的应用 与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。 核酶导入细胞方法 1、外源导入法：可以通过化学合成；也可以采用体外转录方法 2、内源导入法：利用表达载体在细胞内转录产生核酶分子。 新技术 新思路 设计出具核酶活性的反义RNA，既能与mRNA互补结合阻止mRNA的翻译，又带有锤头状结构基因，能对靶序列（mRNA）特异性切割，可反复使用 补充：PCR衍生技术 逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) 定量PCR (quantitative PCR ) 多重PCR (multiplex PCR) 差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR) 原位PCR (in situ PCR) 一、逆转录PCR（RT-PCR） 以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等 逆转录生成cDNA方式： 以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物