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一株纤维素降解菌的筛选与酶活力测定 　　摘 要：从吉林市左家林地土壤中分离得到一株纤维素酶产生菌，由形态观察和18S rDNA序列分析，该菌株为真菌，属散囊菌纲（ Uncultured Eurotiomycetes），命名为JN510。该菌产生纤维素酶活力为2.32IU/mL，具有进一步研究价值。 　　关键词：纤维素酶；菌种筛选；鉴定；酶活力 　　中图分类号： Q936 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20151132001 　　纤维素是农作物秸秆的主要成分之一，也是地球上含量最为丰富的可降解生物质，其为葡萄糖聚合物，以β-1，4糖苷键聚合。它的降解与转化是生物圈碳素循环与生物能传递的重要环节。利用微生物对纤维素进行降解，对于自然界生物能源的利用具有重要意义。世界各国均积极开展对纤维素降解菌的研究[1]。东北地区作为我国的粮食主产区，每年产生大量富含纤维素的农业秸秆，传统的焚烧污染环境且造成大量生物质浪费。 　　本试验从吉林市左家林地土壤中分离出一株纤维素降解菌，由菌丝、菌落形态以及16S rDNA初步鉴定为散囊菌纲（ Uncultured Eurotiomycetes）。其具有较强纤维素酶产酶活性，对于纤维素的降解转化具有积极意义，菌种具有进一步研究价值。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料与试剂 　　1.1.1 试验材料 　　土壤样品，采自吉林省吉林市左家地区林地；化学试剂均为分析纯，购于北京化学试剂厂；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）购自生工生物工程（上海）有限公司。Biospin凝胶回收试剂盒，购自BioFlux公司； 　　1.1.2 培养基 　　富集培养基：MgSO?7H2O 4 0.1g，FeSO4?7H2O 0.1g， K2HPO4 1.0g， MnSO4 5×10-4g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，水1000ml，自然pH，121℃灭菌30min。 　　刚果红筛选培养基：KNO3 2.0g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1.0g，NaCl 1.0g，Na2HPO4 1.0g，蒸馏水500ml，加热溶解后加入CMC-Na 20.0g、琼脂20.0g、刚果红0.2g充分溶解后，蒸馏水定容至1000ml，HCl调pH直至达到7.0～7.2，121℃灭菌30min，摇匀后倒平板。 　　纤维素钠筛选培养基：CMC-Na 5.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂12.0g，，水 1000ml，121℃灭菌30min，摇匀后到平板。 　　产酶培养基：Na2HPO4 3.0g，NH4NO3 0.8g，CaCl2 0.5g，ZnSO40.01g，FeSO4?7H2O 0.01g，MgSO4?7H2O 0.5g，MnSO4?H2O 0.01g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g， 水1000ml，HCl调pH值7.0～ 7.2，121℃灭菌30min，摇匀后到平板。 　　PDA培养基：马铃薯200g，去皮切成小块，用蒸馏水1000ml小火沸煮30min，8层纱布过滤，滤液补水至1000ml，调pH6.5。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 样品采集与菌种分离 　　于左家地区林地，取腐殖质表层土壤5g土样于三角瓶中，加入50ml无菌水，震荡5min，至分散均匀。取5ml悬液于50ml富集培养基，28℃，80r/min震荡培养5～7d。取富集培养液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀释，涂布于刚果红筛选培养基，静置30min后，28℃倒置培养，分离有明显透明水解圈的菌落。若菌落重叠可划线分离菌株。 　　1.2.2 菌株纤维素降解能力测定 　　将分离获得的菌株，液体培养后，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀释后涂布于刚果红筛选培养基，静置30min后，28℃倒置培养，待菌落直径1.0～5.0mm，取下培养基，于1%刚果红溶液浸泡1h，弃去刚果红溶液，于1mol/L NaCl溶液浸泡0.5h，弃去NaCl溶液，观察并测量水解圈大小。 　　1.2.3 纤维素酶活力测定 　　采用DNS法（3，5-二硝基水杨酸法）测定纤维素酶活力 [2]。酶活力定义为：1min内催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1IU。 　　1.2.4 菌株表型特征鉴定 　　取无菌水一滴至于干净玻片，接种环挑取少许菌丝涂布，风干固定，显微观察菌株形态。 　　1.2.5 菌株的18S r DNA鉴定 　　CTAB法提取菌株基因组DNA，分析18S r DNA进行军中鉴定。PCR反应体系（50μL）：dd H2O 34.0μL，10×buffer 5.0μL，d