第五目的基因的获取.pptVIP

开展基因工程首先必须获得基因，因此有特定的功能基因分离和克隆是重组DNA技术中基本和重要的组成部分。 为了体外高效表达特定的生物活性蛋白，首先要分离和克隆相应的基因，这种基因常称为目的基因。 因目的基因片断需插入载体，导入宿主细胞内进行复制或表达，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因或外源性DNA。 目的基因的用途 研究该基因的全貌和内涵, 如详细分析基因结构、功能及调控； 用正常的目的基因与异常基因分析对比，寻找其异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机制及治疗策略； 研究生物种系进化与相关同源性； 采用基因重组技术，使目的基因在体外获得高效表达，生产所需要的生物活性蛋白及多肽（如干扰素、胰岛素等药物）； 通过基因突变、缺失或拼接改造某种目的基因，以改良品种，生产新型的生物活性物质，促经济发展； 建立基因治疗，如选用和克隆某种正常基因，引入患者细胞内，以对某些遗传病、肿瘤等疑难疾病进行基因治疗。 目的基因的获得 1．人工化学合成法 2．PCR法 3．文库筛选法 4．转座子标签法 5．mRNA差别显示技术 6．生物信息技术分离和鉴定目的基因 1．人工化学合成法 1.要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其对应的多肽链氨基酸序列 2）较短的DNA片段，有专一性和定向性 2.仪器：自动化 DNA合成仪 3.原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载体上, 然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3’、5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封闭非反应基团 ），其后用洗涤法除去多余的反应物和副产物, 再用同样的步骤与下一个核苷酸进行缩合反应, 如此循环将合成的寡核苷酸链从载体上洗脱下来, 解除保护基, 进一步纯化。 应用范围： 1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头 4）合成 较小的基因 合成基因时，要注意使用不同物种的偏爱密码子. 1972年Khorana等首先用化学合成法合成了相当于酵母丙氨酸tRNA结构基因的DNA双链 1979年合成了包括启动调节顺序在内, 长207bp的大肠杆菌酪氨酸校正tRNA基因 而后人们又相继合成了生长激素释放抑制因子、胰岛素、生长激素、α和γ干扰素、舒缓激肽、脑啡肽等基因， 2. PCR法分离目的基因 （1）序列已知情况 （2）序列未知情况 （1）根据已知序列，采用PCR分离目的基因 ①已知序列是DNA片段 例如：番茄 defender against apoptotic cell death （LeDAD1）序列 LeDAD1序列 （1）根据已知序列，采用PCR分离目的基因 已知序列是mRNA 　mRNA：首先要分离（或纯化）mRNA A: 根据mRNA序列直接设计引物； B: 根据mRNA序列设计一条引物和OligoT/A引物进行PCR扩增 C: 逆转录，以获得的cDNA为模板，进行PCR扩增。 （2）序列未知，采用PCR分离目的基因 ①序列在其他物种上已有报道： 例如：扩增杨树PDS基因 PDS基因目前已在拟南芥、番茄、甜橙等植物上有报道 具体做法： 　　首先找出上述几个物种的PDS基因序列，进行比对； 　　寻找出其保守序列，根据保守序列设计引物（或简并引物） 　　PCR扩增（DNA或RNA为模板） 见PDS基因设计文档 ②已知部分序列，但不完全，可采取： 反向PCR法（有时也称做染色体步移法）： RACE（ Rapid Amplification of cDNA Ends） 技术 可分为5’-RACE和3’- RACE 5’-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30作为锁定引物在反转录酶MMLV（或AMV）作用下，反转录合成标准第一链cDNA。 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。 然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物2作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来 利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cD